大鼠肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)

 

1  材料

1.1  動(dòng)物

 

出生后1-4天的Wistar乳鼠1只。

 

1.2  試劑

 

PBS、培養(yǎng)液（低糖DMEM，新生牛血清、青*、1%明膠,PBS、0.25%*），碘酒和酒精綿球。

 

1.3  手術(shù)器械

 

眼科直剪2把、眼科彎剪2把、眼科直鑷2把、眼科彎鑷2把、玻璃平皿3套，25cm2塑料培養(yǎng)瓶（Costar）。

 

2  方法

2.1  明膠包被培養(yǎng)瓶過(guò)夜（準(zhǔn)備2-3個(gè)），取出明膠，用2 ml培養(yǎng)液沖洗培養(yǎng)瓶一遍，置于超凈臺(tái)中。

 

2.2  解剖取肺：將乳鼠在酒精中浸泡后取出，轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)上的玻璃培養(yǎng)皿中，用碘酒消毒胸部皮膚，再用酒精棉球脫碘。左手捏緊乳鼠頸背部皮膚以充分展露胸部，右手以眼科直剪剪開(kāi)皮膚，充分撕拉開(kāi)，再用酒精棉球消毒，繼而以另一把眼科彎剪沿胸骨柄左下緣向上剪開(kāi)肋骨，然后在切口中間橫剪胸骨。用*取出肺，置于盛有PBS（含有200 U/ml青*）的玻璃平皿中，沖洗去血。

 

2.3  用眼科剪將肺分成幾個(gè)肺葉，用鑷子去除周邊的血凝塊及纖維組織，用眼科剪剪去肺門(mén)處的支氣管和血管，再用含有雙抗的PBS沖洗1遍。

 

2.4  用眼科彎剪將肺*碎成1 mm3大小，加入含有雙抗的PBS，將肺組織塊吹打開(kāi)，靜置15 min后，更換新的PBS。

 

2.5  用200 μl微量加樣器（是超凈臺(tái)中的，臨用時(shí)用酒精綿球好好擦拭槍柄）取200 μl加樣槍頭一個(gè)，剪去尖，在酒精燈上用火焰燒彎。用槍頭吸取組織塊接種于培養(yǎng)瓶中，每瓶20-25塊左右，每小塊間距0.5 cm左右。組織塊放置好后，輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，讓瓶底朝上，向瓶?jī)?nèi)加入2 ml左右的培養(yǎng)液，蓋好瓶蓋，將培養(yǎng)瓶?jī)A斜放置在溫箱中，干貼壁2-4 h后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，繼續(xù)靜置培養(yǎng)。注意上述操作過(guò)程中動(dòng)作要輕柔，讓液體慢慢覆蓋組織小塊，嚴(yán)禁動(dòng)作過(guò)快致使液體產(chǎn)生的沖力使粘貼的組織塊漂起而造成原代培養(yǎng)失敗。48 h后換液，更換2-3 ml即可。

 

2.6  貼塊貼壁72 h后，鏡下可見(jiàn)大量的成纖維細(xì)胞爬出，將組織塊去除，繼續(xù)培養(yǎng)2-3天，待細(xì)胞長(zhǎng)滿，即可傳代。注：因?yàn)檠鍧舛鹊?，?nèi)皮細(xì)胞可以爬出少量，但是很快就會(huì)死掉。

 

2.7  傳代用0.25%*常規(guī)消化，以1:2傳代，傳代完后，采用差速貼壁法純化一次，即待細(xì)胞貼壁1.0-1.5 h后（即絕大多數(shù)成纖維細(xì)胞都已經(jīng)貼壁），棄去未貼壁的細(xì)胞和培養(yǎng)液，更換新的培養(yǎng)液。

 

 

圖1 成纖維細(xì)胞

 

 

圖2 成纖維細(xì)胞

 

3  結(jié)果

 

成纖維細(xì)胞為長(zhǎng)梭形形態(tài)，常呈漩渦狀生長(zhǎng)。

 

4  討論

 

一般來(lái)說(shuō)，貼塊培養(yǎng)法，只要不加一些選擇性的添加物（血清濃度 10%，不加生長(zhǎng)因子，不加肝素，不加*等），zui后成纖維細(xì)胞必然成為優(yōu)勢(shì)細(xì)胞，因?yàn)椋壕奘杉?xì)胞是終末細(xì)胞；內(nèi)皮細(xì)胞較嬌氣；平滑肌細(xì)胞貼壁慢，也不容易爬出；肺上皮細(xì)胞會(huì)被血清抑制，增殖能力也很弱。所以，成纖維細(xì)胞是很容易培養(yǎng)的。