染料法熒光PCR的數(shù)據(jù)與探針法的相比，除了擴(kuò)增曲線之外，還增加了熔解曲線分析。如何確定數(shù)據(jù)是好是壞？好的話，數(shù)據(jù)可以使用；壞的話，需要查明原因，擬定下一步的體系優(yōu)化方案。這里探討如何確定數(shù)據(jù)是好是壞，如果不好，查明原因，如何擬定下一步的優(yōu)化方案。

熔解曲線分析

熔解曲線分析是在定量PCR中常用的一種定量測(cè)定方法。

原理：由于在PCR定量分析中利用的是在低溫復(fù)性後，擴(kuò)增產(chǎn)物會(huì)按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合成DNA雙鏈，而有的熒光素在與雙鏈DNA結(jié)合產(chǎn)生活化，能產(chǎn)生熒 光效應(yīng)。但由于反應(yīng)中存在少量的非特異聚合體（如引物二聚體等），能引起干擾，但非特異聚合體的熔解溫度較特異性結(jié)合低，當(dāng)擴(kuò)增結(jié)束後，再緩慢加溫，當(dāng) DNA變性後，染料被釋放，熒光減少，而非特異性結(jié)合先于特異性結(jié)合減少，對(duì)熔解過(guò)程進(jìn)行連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)可得熔解曲線，通過(guò)曲線將非特異性訊號(hào)和特異性訊號(hào) 區(qū)分出來(lái)，同時(shí)對(duì)特異性訊號(hào)區(qū)，熒光減少的快慢與濃度的對(duì)數(shù)成正比。

目的：減小非特異性結(jié)合和引物二聚體的影響。用導(dǎo)數(shù)來(lái)提高分析率。

用途：除正常測(cè)定外，可用來(lái)進(jìn)行突變分析。

方法：1.在擴(kuò)增完後，緩慢升高溫度，同時(shí)對(duì)熒光進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)，可以得到如下曲線：t1是擴(kuò)增終點(diǎn)，t2是非特異性結(jié)合分離點(diǎn)，t3是DNA開始變性點(diǎn)。

 

2.分析上圖可知，t3以後是特異結(jié)合分離區(qū)，其熒光下降速度與終點(diǎn)擴(kuò)增的基因成正比，但因?yàn)閿U(kuò)增是按等比數(shù)列增長(zhǎng)，因此實(shí)際上是特異結(jié)合分離區(qū)熒光下降速度與樣本含量的對(duì)數(shù)成正比。由公式可得出標(biāo)本濃度。

優(yōu)點(diǎn)：熔解曲線法定量PCR，排除非特異性結(jié)合的干擾，提高了測(cè)定的準(zhǔn)確性和靈敏度，同時(shí)還能用于基因突變的分析。（原理：含突變位點(diǎn)的基因結(jié)合較正?；虿环€(wěn)定）

以下面的數(shù)據(jù)為例，通過(guò)熔解曲線和擴(kuò)增曲線相結(jié)合，來(lái)介紹染料法熒光PCR數(shù)據(jù)分析的簡(jiǎn)單流程。

舉例一、選取同一個(gè)基因，先看擴(kuò)增曲線（RN VS CYCLER）：

 

擴(kuò)增曲線成s 型，形態(tài)可以；再看擴(kuò)增曲線（Delta RN VS CYCLER）：

 

Delta RN VS CYCLER 的擴(kuò)增曲線形態(tài)也是比較標(biāo)準(zhǔn)的；二者都很正常時(shí)，再轉(zhuǎn)向熔解曲線， 這時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)熔解曲線不太正常。

 

熔解曲線比較雜亂，有的溶解曲線是雙峰，有的熔解曲線是單峰，report 表示，有的tm在85度，有的是在89度。峰的位置也不相同。需要仔細(xì)分析，通過(guò)復(fù)孔，陰性對(duì)照等來(lái)分析數(shù)據(jù)。疑問(wèn)是：產(chǎn)物是否相同？不同Tm的報(bào)告是真實(shí)的還是儀器的一種誤差？

值得提醒的是，不同儀器的report 結(jié)果不同，如ABI 的7000系列，只report 主要的tm；；而rotorgene 系列，則會(huì)報(bào)告每一個(gè)小峰的tm。

仔細(xì)看每個(gè)孔，選取其中正確的熔解曲線：

 

正確的熔解曲線：在某一特定溫度處有尖銳的單峰，該峰所在的溫度Tm，一般與引物設(shè)計(jì)及合成時(shí)的預(yù)測(cè)值比較接近。從樣本的角度，即采用了什么樣得樣本，孔 位置的角度（這幾個(gè)結(jié)果好的樣本孔是否相連，是否位于擴(kuò)增儀的同排或者同列的位置），復(fù)孔的情況是否相似；操作的角度來(lái)進(jìn)行分析和判斷；

正確的熔解曲線的數(shù)據(jù)，它的CT值是可以用的，可以進(jìn)行成對(duì)的數(shù)據(jù)分析，如進(jìn)行Δct分析。

不正確的熔解曲線的數(shù)據(jù)，要分析形成的原因。

選擇熔解曲線結(jié)果不好的孔，來(lái)分析：

 

這幾個(gè)孔的熔解曲線出現(xiàn)了雙峰，甚至三峰；峰的位置是否相同；結(jié)果是否可以認(rèn)為是類似的原因造成的？ *峰的位置和第二峰的位置是否可以認(rèn)為是一樣的；通過(guò)調(diào)整程序是否能降低非特異反應(yīng)？

復(fù)孔的情況怎么樣：

 

分析所有復(fù)孔情況，看結(jié)果是否吻合。上圖的這個(gè)熔解曲線是復(fù)孔的熔解曲線，這樣可以說(shuō)明，在一定程度存在非特異擴(kuò)增的時(shí)候，第二峰的tm可能有一定差異；而這是兩個(gè)相同樣本的結(jié)果。而熔解曲線結(jié)果比較好的時(shí)候，復(fù)孔的結(jié)果也是不錯(cuò)的。

好的熔解曲線和差的熔解曲線放在一起分析：

 

上圖中有一對(duì)復(fù)孔熔解曲線比較好，基本可以認(rèn)為是單峰；一對(duì)復(fù)孔熔解曲線出現(xiàn)了雙峰；其實(shí)仔細(xì)看，好的熔解曲線前面也有一個(gè)很小很小的峰，位置和不好的雙峰是相同的。那么可以認(rèn)為，差的熔解曲線也出現(xiàn)了特異性產(chǎn)物，雖然前面有一個(gè)非特異的峰。

好的熔解曲線和差的熔解曲線放在一起分析，轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)看擴(kuò)增曲線：

 

經(jīng)常要對(duì)應(yīng)二者來(lái)看的。

再看陰性對(duì)照的熔解曲線是正常的，未被污染。再來(lái)看熔解曲線：

 

基本上分成兩種；好的和不好的；而不好的與好的，在熔解曲線的峰上就分析而言，是吻合的；需要調(diào)整程序，降低非特異性擴(kuò)增；具體表現(xiàn)在程序上，就是提高退火溫度，縮短延伸時(shí)間。

結(jié)論：基本得到目的產(chǎn)物，下一步工作是優(yōu)化反應(yīng)程序，提示：提高退火溫度，縮短延伸時(shí)間；

如果采用統(tǒng)一退火反應(yīng)條件，對(duì)于不好的引物，建議直接重新設(shè)計(jì)引物，合成，以便得到好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

原文地址:/biotech/exp/PCR/2011/h821102252.html