DNA重組技術(shù)的操作步驟

一個典型的DNA重組包括五個步驟： 　?。?）目的基因的獲取 　　目前，獲取目的基因的方法主要有三種：反向轉(zhuǎn)錄法、從細胞基因組直接分離法和人工合成法。 　　反向轉(zhuǎn)錄法是利用mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得目的基因的方法。從細胞基因組中直接分離目的基因常用"鳥槍法"，因為這種方法猶如用散彈打鳥,所以又稱"散彈槍法"。用"鳥槍法"分離目的基因，具有簡單、方便和經(jīng)濟等優(yōu)點。許多病毒和原核生物、一些真核生物的基因，都用這種方法獲得了成功的分離。 化學合成目的基因是20世紀70年代以來發(fā)展起來的一項新技術(shù)。應(yīng)用化學合成法，可在短時間內(nèi)合成目的基因?？茖W家們已相繼合成了人的生長激素釋放抑制素、胰島素、干擾素等蛋白質(zhì)的編碼基因。 （2）DNA分子的體外重組 　　體外重組是把載體與目的基因進行連接。例如，以質(zhì)粒作為載體時，首先要選擇出合適的限制性內(nèi)切酶，對目的基因和載體進行切割，再以DNA連接酶使切口兩端的脫氧核苷酸連接，于是目的基因被鑲嵌進質(zhì)粒DNA，重組形成了一個新的環(huán)狀DNA分子（雜種DNA分子）。 （3）DNA重組體的導(dǎo)入 把目的基因裝在載體上后，就需要把它引入到受體細胞中。導(dǎo)入的方式有多種，主要包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、顯微注射、微粒轟擊和電擊穿孔等方式。轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)主要適用于細菌一類的原核生物細胞和酵母這樣的低等真核生物細胞，其他方式主要應(yīng)用于高等動植物的細胞。 （4）受體細胞的篩選 由于DNA重組體的轉(zhuǎn)化成功率不是太高，因而，需要在眾多的細胞中把成功轉(zhuǎn)入DNA重組體的細胞挑選出來。應(yīng)事先找到特定的標志，證明導(dǎo)入是否成功。（5）基因表達 目的基因在成功導(dǎo)入受體細胞后，它所攜帶的遺傳信息必須要通過合成新的蛋白質(zhì)才能表現(xiàn)出來，從而改變受體細胞的遺傳性狀。目的基因在受體細胞中要表達，需要滿足一些條件。例如，目的基因是利用受體細胞的核糖體來合成蛋白質(zhì)，因此目的基因上必須含有能啟動受體細胞核糖體工作的功能片段。