雞孕酮（PROG）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用

檢測范圍：0.2 ng/ml-100 ng/ml

zui低檢測限：0.1 ng/ml

特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的PROG，且與其他相關(guān)蛋白基本無交叉反應(yīng)。

有效期：6個月（2-8℃避光保存）

預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測定雞血清，血漿及其它相關(guān)生物液體中PROG含量。

說明

1.        濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

2.        剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。

實驗原理

采用競爭酶聯(lián)免疫法法檢測PROG含量。首先用一株單抗體包被微孔板，制備成固相抗體，然后加入待測標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品，辣根過氧化物酶標(biāo)記的PROG以及抗PROG抗體，使之形成包被抗體-抗PROG抗體-PROG（HRP）復(fù)合物。經(jīng)顯色后在酶標(biāo)儀測定吸光值（OD值），通過計算機或作圖擬合濃度-吸光度曲線，反算出待測標(biāo)本中PROG含量。

試劑盒組成及試劑配制

1.        酶聯(lián)板（Assay plate ）：                                   一塊（96孔）。

2.        標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）：                                    5瓶（凍干品）。

標(biāo)準(zhǔn)品為凍干品，使用前分別用0.5ml蒸餾水溶解，溶解后濃度分別為：

3.        抗體（antibody）：                                        1×6ml/瓶。

4.        酶結(jié)合物（HRP-conjugate）：                              1×6ml/瓶。

5.        顯色劑A（Substrate A）：                                   1×7ml/瓶。

6.        顯色劑B（Substrate B）：                                   1×7ml/瓶。

7.        濃洗滌液（Wash Buffer）：    1×15ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋20倍。

8.        終止液（Stop Solution）：                                   1×7ml/瓶

需要而未提供的試劑和器材

1.        標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀

2.        高速離心機

3.        電熱恒溫培養(yǎng)箱

4.        干凈的試管和Eppendof管

5.        系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器

6.    蒸餾水，容量瓶等

標(biāo)本的采集及保存

1.        血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2.      血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3.      細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：以上標(biāo)本置4℃保存應(yīng)小于1周，-20℃或-80℃均應(yīng)密封保存，-20℃不應(yīng)超過1個月，-80℃不應(yīng)超過2個月；標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測。

操作步驟

1.        將各種試劑至室溫〔18-25℃〕平衡半小時，取濃縮洗滌液，根據(jù)當(dāng)批檢測數(shù)量，用蒸餾水上1：20稀釋，混勻后備用。

2.        標(biāo)準(zhǔn)品Standard 1- Standard 5，*次使用前先用0.5ml蒸餾水溶解，放置混勻后使用。

3.        將酶標(biāo)板取出，設(shè)一個空白對照孔、不加任何液體；每個標(biāo)準(zhǔn)點依次各設(shè)兩孔，每孔加入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品50ul；其余每個檢測孔直接加待測標(biāo)本50ul。

4.        每孔加入酶結(jié)合物50ul（空白對照孔除外），再各加入抗體50 ul，充分混勻，貼上不干膠封片，置37℃溫育1小時。

5.        手工洗板，棄去孔內(nèi)液體。洗滌液注滿各孔，靜置10秒甩干，重復(fù)三次后拍干；洗板機洗板，選擇洗滌三次程序，洗板后拍干。

6.        每孔加顯色劑A液50μl，顯色劑B液50μl，振蕩混勻后，37℃避光顯色15分鐘，每孔加終止液50μl。

7.        用酶標(biāo)儀讀數(shù)，取波長450nm，先用空白孔調(diào)零點，然后測定各孔OD值。

數(shù)據(jù)處理

1.        手工作圖：用雙對數(shù)坐標(biāo)紙，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫軸，以對應(yīng)的0D值為縱軸，畫出平滑曲線或直線，在曲線上按照待測血清OD值找到對應(yīng)的濃度值。

2.        計算機：使用線性擬合功能，應(yīng)將標(biāo)準(zhǔn)品S1-S5的濃度取對數(shù)（Log（濃度））作為X，將對應(yīng)的OD值減去空白對照孔OD值后取對數(shù)（Log（OD值-NSB））作為Y，進(jìn)行線性擬合。再從擬合線上計算出待測血清濃度。

注意事項

1.        從冷藏環(huán)境中取出的試劑盒內(nèi)全部瓶裝試劑及所需預(yù)包被板條應(yīng)置室溫

（18-25℃）平衡30分鐘后方可使用，余者應(yīng)及時封好口，放回2-8℃中避光保存，以備后用。

2.        使用前試劑應(yīng)搖勻。

3.        結(jié)果判斷須在反應(yīng)終止后10分鐘內(nèi)完成。

4.        不同批號的試劑不可混用。

5.        加樣時應(yīng)注意避免所用各試劑及樣品之間的交又污染。

6.        操作時，試劑盒內(nèi)每種試劑各使用一個吸頭，每一種標(biāo)準(zhǔn)品使用一個吸頭，每一個樣品各使用一個吸頭，吸頭一次性使用。  

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