檢查過程

() 蛋白質(zhì)樣品獲得：細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)后，可通過電泳上樣緩沖液直接裂解細(xì)胞，真核細(xì)胞加勻漿緩沖液，機(jī)械或超聲波室溫勻漿0.5-min。然后4℃，3,000g離心5min。取上清液作為樣品。

(2) 電泳：制備電泳凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE。　

(3) 轉(zhuǎn)移：(半干式轉(zhuǎn)移)

① 電泳結(jié)束后將膠條割至合適大小，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡，5min×3次。

② 膜處理：預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中0min。

③ 轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、NC膜對齊，每一步去除氣泡，上壓500g重物，將碳板上多余的液體吸干。接通電源,恒流mA/cm2，轉(zhuǎn)移.5hr。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開電源將膜取出,割取待測膜條做免疫印跡。將有蛋白標(biāo)準(zhǔn)的條帶染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然后用雙蒸水洗，風(fēng)干夾于兩層濾紙中保存，留與顯色結(jié)果作對比。

(4) 免疫反應(yīng)：　

① 用0.0M PBS洗膜，5min ×3次。

② 加入包被液，平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫2hr?！?strong>細(xì)胞

③ 棄包被液，用0.0M PBS洗膜，5min×3次。　

④ 加入一抗(按合適稀釋比例用0.0M PBS稀釋，液體必須覆蓋膜的全部)，4℃ 放置2hr以上。陰性對照，以%BSA取代一抗，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同?！?br>

⑤ 棄一抗和%BSA，用0.0M PBS分別洗膜，5min×4次?！?br>

⑥ 加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(按合適稀釋比例用0.0M PBS稀釋)，平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫2hr。　

⑦ 棄二抗，用0.0M PBS洗膜，5min×4次?！?br>

8、加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時(shí)放入雙蒸水中終止反應(yīng)。細(xì)胞