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武漢紐斯特生物科技有限公司
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更新時間：2024-05-02 09:18:42瀏覽次數(shù)：65次
聯(lián)系我時，請告知來自 環(huán)保在線Configuration-specificMonoclonalAntibodyBasedRacActivationAssayKitCatalogNumber：8050120assays產(chǎn)品說明小G蛋白是從屬于細胞調(diào)節(jié)因子中的一個超家族
Configuration-specific Monoclonal Antibody Based
Rac Activation Assay Kit
Catalog Number：80501
20 assays
產(chǎn)品說明
小 G 蛋白是從屬于細胞調(diào)節(jié)因子中的一個超家族。Rho 家族是小 G 蛋白中的一個亞家族，它在細胞運動、細胞分裂以及基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮主要作用。而本試劑盒中的 Rac 就屬于Rho 亞家族中的一種， Rac 參與生理活動過程中其分子結(jié)構(gòu)會呈現(xiàn)出 2 種相互轉(zhuǎn)換的形式：與 GTP 結(jié)合的激活狀態(tài)和與 GDP 結(jié)合的非活性狀態(tài)。
目前 Rac 蛋白活性的檢測主要是依據(jù)小 GTP 酶 Rac 可以與 p21 活化激酶（PAK）的 p21結(jié)合區(qū)域（PBD）結(jié)合，使 PAK 活化從而發(fā)揮生物學(xué)功能，進而間接的進行 Rac 活性功能的監(jiān)測。然而此方法在檢測過程中存在著一定的局限性比如 GTP 水解成 GDP 的速度過快以及 Rac-GTP 結(jié)合蛋白與 PBD 結(jié)合區(qū)域之間較低的親和力，導(dǎo)致這種檢測方法的重復(fù)性較差。
而武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司推出的 Rac 活性檢測試劑盒主要是依據(jù)單克隆抗體能夠特異性的識別特殊構(gòu)象的 Rac-GTP 結(jié)合蛋白，而不識別 Rac-GDP 結(jié)合蛋白，進而簡單并且快速的進行 Rac 的活性檢測。同時試劑盒中的 Rac-GTP 單克隆抗體也可以進行免疫組化實驗中細胞和組織中 Rac 的活性監(jiān)測。每套試劑盒可以進行 20 次檢測。
檢測原理
武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的 Rac 活性檢測試劑盒主要是利用識別蛋白特異構(gòu)象的Rac-GTP 單克隆抗體特異性的去檢測細胞提取物或者體外的（樣品需要進行 GTPγS 活化處理）活性 Rac-GTP 的水平。簡言之，特異性識別 Rac 活化構(gòu)象的鼠單克隆抗體可以特異性結(jié)合細胞裂解液中的 Rac-GTP 活性蛋白，然后利用 protein A/G 將抗原抗體的結(jié)合物吸附下來，再利用特異性識別 Rac 活化構(gòu)象的兔多克隆抗體進行免疫印跡分析進行檢測。
試劑盒成分
1. 特異性識別 Rac 活性構(gòu)象的鼠單克隆抗體（Anti-active Rac, Mouse Monoclonal Antibody(Catalog No. 26903)）： 小管裝--30ul (抗體濃度是 1mg/ml)，抗體溶于 PBS（pH 7.4）并包含 50%的甘油和 0.05%的。此抗體可以特異性識別所有脊椎動物中的 Rac-GTP。
2. Protein A/G agarose (Catalog No. 30301) ：小管裝—400ul 包含 200ul Protein A/G agarose
和 200ul 20%乙醇溶液。（使用時溶液需要充分混勻，再吸?。?nbsp;
3. 5X Assay/Lysis Buffer (Catalog No. 30303)：小瓶裝—30mL 包含 250 mM Tris-HCl (pH 8.0),
750 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 5 mM EDTA, 5% Triton X-100。
4. 特異性識別 Rac 活性構(gòu)象的兔多克隆抗體（Anti-Rac, Rabbit Polyclonal Antibody (Catalog
No.21003)）：小管裝--30ul (抗體濃度是 1mg/ml)，抗體溶于 PBS（pH 7.4）并包含有 50%
的甘油。
5. 100 X GTPγS (Catalog No. 30302) ：小管裝—100ul (10 mM) ，實驗中 0.5mL 細胞裂解
液使用 5ul GTPγS 標(biāo)記。
6. 100 X GDP (Catalog No. 30304) ：小管裝—100ul (100 mM) ，實驗中 0.5mL 細胞裂解液
使用 5ul GDP 標(biāo)記。
儲存條件
試劑盒的成分在試劑盒的有效期限內(nèi)必須存放于 4°C 條件下保存。
試劑（試劑盒內(nèi)不提供，由實驗者自行配置）
1. 刺激和未刺激的細胞裂解物；
2. 蛋白酶抑制劑；
3. 4 °C 搖桿或者搖床；
4. 0.5 M EDTA (pH 8.0)；
5. 1 M MgCl2；
6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer；
7. 電泳和免疫印跡相關(guān)試劑；
8. 免疫印跡緩沖液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05%
Tween-20)；
9. 免疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA)；
10. PVDF 或硝酸纖維素膜；
11. 二抗；
12. ECL 檢測試劑；
試劑制備
1X Assay/Lysis Buffer：實驗前用去離子水將 5X 的 Assay/Lysis 緩沖液稀釋成 1X 的緩沖液，并在使用前加入蛋白酶抑制劑如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 µg/mL
aprotinin（）。
樣品處理
貼壁細胞
1. 培養(yǎng)細胞密度達到大約 80%-90%之間（直徑 10 cm 培養(yǎng)皿，~10
7
個細胞），并用活性劑
或抑制劑進行處理。
2. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。
3. 向細胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。
4. 將培養(yǎng)皿放置于冰上處理 10-20 分鐘。
5. 用細胞刮棒把細胞從培養(yǎng)皿下分離下來。
6. 將細胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。
7. 如果核發(fā)生裂解，細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時，
將細胞裂解物用 27?的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因組 DNA，從而避免上述
情況的出現(xiàn)。
8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。
9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的
樣品存放于-70°C 條件下。
懸浮細胞
1. 培養(yǎng)細胞并用活化劑或抑制劑進行處理。
2. 計數(shù)細胞后離心。
3. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。
4. 向細胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。
5. 反復(fù)吹打細胞進行裂解。
6. 將細胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。
7. 如果核發(fā)生裂解，細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時，
將細胞裂解物用 27?的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因組 DNA，從而避免上述
情況的出現(xiàn)。
8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。
9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的
樣品存放于-70°C 條件下。
體外用 GTPγS/GDP 處理蛋白以用作陽性和陰性的對照
注意：在細胞體內(nèi)環(huán)境條件下大約有 10%的 Rac 被激活，而在體外用 GTPγS 處理大約有
90%的 Rac 被激活。
1. 準(zhǔn)備兩個離心管，每個管中各加入 0.5 mL 的細胞提取物（如果是純的 Rac 蛋白則每個
管中加入的蛋白量為 1ug）。
2. 每個管中加入 20ul 0.5M EDTA(終濃度即為 20 mM)。
3. 一個管中加入 5ul 的 100X GTPγS（終濃度即為 100 uM）作為陽性對照。另一個管中加
入 5ul 的 100X GDP（終濃度即為 1 mM）作為陰性對照。
4. 將離心管置于 30°C 條件下反應(yīng) 30 min 并不斷攪動。
5. 終止反應(yīng)：將管置于冰上并加入 32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為 60mM)。
檢測步驟
Ι?；钚?Rac Pull-Down 實驗
1. 等分 0.5-1 mL(總蛋白的含量大約為 1mg)的細胞裂解物至微量離心管中。
2. 向管中加入 1mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液。
3. 向管中加入 1ul 的活性 Ras 單克隆抗體。
4. 用渦旋振蕩儀將 protein A/G 凝膠柱充分混勻，然后快速的吸出 20ul 懸浮珠漿液加入離心
管中。
5. 將管置于 4°C 條件下孵育 1H，并輕輕的進行搖動。
6. 5000g，離心 1 分鐘。
7. 棄上清，這一步要非常小心以避免珠子的損失。
8. 用 0.5 mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液洗滌珠子三次，離心并棄去上清。
9. 次洗滌后，小心的移去所有的上清。
10. 用 20ul 的 2X SDS-PAGE 樣品緩沖液重懸樣品。
11. 樣品煮沸 5min。 12. 5000g，離心 10s。
II. 電泳和轉(zhuǎn)膜
1. 取 15ul 樣品/孔上樣 17%配體膠。
2. 按照制造商的說明進行 SDS-PAGE。
3. 按照制造商的說明將凝膠蛋白轉(zhuǎn)到 PVDF 或硝化纖維素膜。
III.免疫印跡反應(yīng)和檢測（所有步驟都是在室溫下進行，并不斷攪拌）
1. 將 PVDF 膜浸入 99%甲醇 15s，然后在室溫放置 5 min 晾干。 注意：如果使用的是硝化纖維素膜，此步省略。
2. 封閉：用 TBST 緩沖液配制 5%的脫脂牛奶或者 3%BSA 在室溫下孵育 1H 進行封閉，并 需要恒定振蕩。
3. 孵育一抗：用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 稀釋特異性識別 Rac 活性構(gòu) 象的兔多克隆抗體（稀釋比例為 1:50-1:1000，主要根據(jù)樣品中含有的 Rac 蛋白的量）， 室溫下孵育 1-2 小時，或者 4°C 條件下過夜孵育。
4. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。
5. 孵育二抗：（例如羊抗兔 IgG-HRP），用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 按 1:1000 稀釋比例稀釋后使用，室溫下孵育 1 小時并恒定振蕩。
6. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。
7. 使用實驗者所選擇的檢測方法進行顯色如 ECL 顯色法。
示例結(jié)果
下圖展示的是武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的 Rac 活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考。
Rac 活性分析。
小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）用血小板衍生因子（PDGF）處理（Lane 2）和未處理（Lane 1）。細胞裂解物用特異性識別 Rac 活性構(gòu)象的鼠單克隆抗體(Cat. # 26903)孵育(上圖)。活性 Rac 珠子顆粒用特異性識別 Rac 活性構(gòu)象的兔多克隆抗體(Cat # 21003)進行免疫印跡實驗。底部的圖展示的是細胞裂解液的活性 Rac 的 Western blot 實驗結(jié)果。（底圖 SDS-PAGE 的上樣量是上圖 SDS-PAGE 上樣量的 5%。）
| Related Products | |||
| Catalog# | Name | Size | Price |
| Rac Activation Assay Kit | 20 assays | ￥6800 | |
| Active Rac1-GTP Monoclonal Antibody | 30 μL | ￥4800 | |
| Anti-Rac1 Mouse Monoclonal Antibody | 100 μL | ￥2800 | |
| Anti-Rac1 Rabbit Polyclonal Antibody | 100 μL | ￥2600 | |
| Anti-Rac2 Rabbit Polyclonal Antibody | 100 μL | ￥2600 | |
| 參考文獻 |
| 1. Pflugers Arch. 2013 Feb;465(2):333-41 |
| 2. Circ Res. 2012 Jan 20;110(2):295-303 |
| 3. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Oct 23;109(43):17681-6 |
| 4. Cardiovasc Res. 2011 Jun 1;90(3):565-72 |
| 5. Gen Comp Endocrinol. 2011 Sep 15;173(3):467-74 |
| 6. PLoS One. 2011;6(11):e27187 |
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| 9. PLoS One. 2013 Aug 28;8(8):e72155 |
| 10. Biochemistry. 2009 May 26;48(20):4417-22 |
| 11. Journal of Molecular and Cellular Cardiology Volume 60, July 2013, Pages 72–83 |
| 12. genetics.113.152660v1 194/4/885 |
| 13. Redox Biology Volume 1, Issue 1, 2013, Pages 498–507 |
| 14. Journal of Cardiovascular Pharmacology: November 2014 - Volume 64 - Issue 5 - p 452-459 |
| 15. Hepatology Volume 60, Issue 6, pages 1929–1941, December 2014 |
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