熒光染色是分子生物學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。今天，我們來淺談熒光染色的一些基本實(shí)驗(yàn)步驟。這里以細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中普通熒光染色為主，展開對實(shí)驗(yàn)步驟的介紹。

對熒光信號的檢測常用的儀器主要有普通熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡。因此，一般需要準(zhǔn)備爬片或者是激光共聚焦培養(yǎng)皿。

爬片：是一種經(jīng)過特殊表面處理的玻片，常用的一般是24孔板配套的14mm直徑圓形玻片。除此之外還有6孔板，12孔板，48孔板等不同規(guī)格的爬片。經(jīng)過特殊處理的爬片可以讓細(xì)胞很好地黏附，但遇到粘附性極差地細(xì)胞，要保證它們正常黏附，可以使用細(xì)胞貼壁黏附劑，促進(jìn)其貼壁能力。

激光共聚焦培養(yǎng)皿：是一種中間有凹槽的小皿，用它的好處在于可以省去爬片制作的流程，但也要注意的是，有的普通熒光顯微鏡是無法檢測激光共聚焦培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，所以大家也要根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件選擇適宜的載體。

選擇好載體后，接下來要做的就是細(xì)胞接種。細(xì)胞接種的密度在1*105-1*106之間，因?yàn)椴煌?xì)胞生長速度不一樣，可以大致摸一下最適細(xì)胞接種濃度。將細(xì)胞以最適濃度接種于含爬片的24孔板內(nèi)或者激光共聚焦培養(yǎng)皿中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱24小時(shí)（培養(yǎng)時(shí)間可以根據(jù)需要調(diào)整），使細(xì)胞貼壁。然后就是對細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的處理，比如藥物啊，根據(jù)實(shí)際情況選擇。

處理結(jié)束后，用4%多聚甲醛對細(xì)胞進(jìn)行固定10-15min，用PBS進(jìn)行漂洗兩到三次。Triton X-100對細(xì)胞進(jìn)行通透，增強(qiáng)細(xì)胞膜通透性，便于熒光染料進(jìn)入細(xì)胞。

熒光染色：按熒光試劑盒說明書操作

復(fù)染：一般用DAPI染核（確定核的位置），DAPI染料染10min,PBS漂洗兩到三次。

封片：取出爬片。操作小技巧，最后漂洗的PBS留在孔內(nèi)，不要吸出來，一手持鑷子，一手持注射針，用針尖將爬片挑起（如果能將針尖彎成一個(gè)小鉤，就更方便了），鑷子取出，在載玻片上滴上約20ul封片劑（抗熒光猝滅劑），將帶細(xì)胞一面朝下，使封片劑均勻覆蓋爬片。激光共聚焦培養(yǎng)皿就無須取出爬片了。

采集圖像：普通熒光顯微鏡汞燈需要預(yù)熱，達(dá)到穩(wěn)定后使用，圖像采集過程中保證對焦清晰，背景盡量是黑色，最好不要過曝，熒光容易猝滅，宜盡快采集圖像。

圖像處理; 采集圖像后，我們會將DAPI和目的熒光的圖像Merge在一起。當(dāng)然，有的還會計(jì)數(shù)或者分析熒光強(qiáng)度，可以用ImageJ軟件進(jìn)行。

至于免疫熒光，其他操作基本相同，常用的也是4%多聚甲醛對細(xì)胞進(jìn)行固定10-15min，用PBS進(jìn)行漂洗兩到三次。0.25%的Triton X-100對細(xì)胞進(jìn)行通透10min，但接下來用3%左右的BSA室溫半小時(shí)對多余位點(diǎn)進(jìn)行封閉是普通熒光染色沒有的。隨后就是孵育一抗，室溫1-2h或者4℃過夜，PBS洗滌，孵育帶熒光的二抗，PBS洗滌，封片（抗熒光猝滅劑）。