轉(zhuǎn)化敘利亞地鼠胚胎細(xì)胞實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)步驟:

1、取材:妊娠后第13天取材,取數(shù)個(gè)同窩胚胎,去頭和內(nèi)臟,在無菌條件下剪碎至米粒大小,再用0.25％ (含0.01％EDTA)37℃消化30分鐘,濾過、低速離心、吸除消化液、加入營(yíng)養(yǎng)液、制備成細(xì)胞懸液、接種入75cm/培養(yǎng)瓶中,接種密度10～20×106/75cm,37℃培養(yǎng)2～3天,在順利情況下能迅速長(zhǎng)滿瓶面.

2、貯存:選大批生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞凍存,儲(chǔ)以備用.

3、致癌物處理:取凍存細(xì)胞,解凍,接種于25ml培養(yǎng)瓶中,每瓶含細(xì)胞10萬～30萬.待 細(xì)胞生長(zhǎng) 進(jìn)入指數(shù)增生期時(shí),向培養(yǎng)瓶中加入致癌劑MNNG.致癌劑量1～3微克/毫升營(yíng)養(yǎng)液.在37℃溫箱中培養(yǎng)12～48小時(shí).

4、低血清培養(yǎng):棄掉MNNG作用液,用溫 PBS 洗1～3次,加入含20％小牛血清,繼續(xù)置溫箱中培養(yǎng)2～3周,然后改用含5％血清培養(yǎng)液培養(yǎng).低血清培養(yǎng)液不利于正常細(xì)胞生長(zhǎng),但已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞仍能增殖和形成轉(zhuǎn)化灶.

5、轉(zhuǎn)化灶形成和分離:在成功情況下,用致癌物處理過的細(xì)胞于10天后在正常細(xì)胞之間,可產(chǎn)生數(shù)量不等的轉(zhuǎn)化灶.