引物是決定 PCR 結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計在 PCR 反應(yīng)中極為重要。要保證 PCR反應(yīng)能準(zhǔn)確、特異、有效地對模板 DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，通常引物設(shè)計要遵循以下幾條原則：
?、?引物的長度以 15-30bp 為宜，一般(G+C)的含量在 45-55%，Tm 值高于 55℃[Tm=4(G+C)+2(A+T)]。應(yīng)盡量避免數(shù)個嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，堿基的分布應(yīng)表現(xiàn)是隨機(jī)的。
⑵ 引物的 3’端不應(yīng)與引物內(nèi)部有互補(bǔ)，避免引物內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)，兩個引物在 3’端不應(yīng)出現(xiàn)同源性，以免形成引物二聚體。3’端末位堿基在很大程度上影響著 Taq 酶的延伸效率。兩條引物間配對堿基數(shù)少于 5 個，引物自身配對若形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖的堿基對數(shù)不能超過 3 個由于影響引物設(shè)計的因素比較多，現(xiàn)常常利用計算機(jī)輔助設(shè)計。
?、?人工合成的寡聚核苷酸引物需經(jīng) PAGE 或離子交換 HPLC 進(jìn)行純化。
?、?引物濃度不宜偏高，濃度過高有兩個弊端：一是容易形成引物二聚體(primer-dimer)，二是當(dāng)擴(kuò)增微量靶序列并且起始材料又比較粗時，容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般說來，用低濃度引物不僅經(jīng)濟(jì)，而且反應(yīng)特異性也較好。一般用 0.25-0.5pM/μl 較好。
?、?引物一般用 TE 配制成較高濃度的母液(約 100μM)，保存于-20℃。使用前取出其中一部分用 ddH2O 配制成 10μM 或 20μM 的工作液。
