實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析的部分實(shí)施需要經(jīng)過優(yōu)化以確保所有反應(yīng)參數(shù)均設(shè)置精確，從而獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。如果出現(xiàn)了引物二聚體，有許多方法可以減少或消除反應(yīng)中的引物二聚體。

1、首先是優(yōu)化熱循環(huán)條件，這主要是提高退火溫度。大多數(shù)情況下，兩步循環(huán) (由 95°C 變性步驟直接進(jìn)入60°C 退火和延伸步驟) 有利于強(qiáng)效擴(kuò)增，因此引物設(shè)計(jì)時(shí)設(shè)定的成功退火溫度為 60°C。 

2、可降低引物濃度，甚至采用不同的正向引物和反向引物的比值也有一定的幫助。大多數(shù)情況下，每條引物的理想最終濃度為 200 nM，但如有需要，可將濃度降至 60 nM。 

3、鎂的最佳濃度一般約為 3 mM。高于此濃度易形成引物二聚體。

4、如果未對引物形成二聚體的傾向進(jìn)行評估，則應(yīng)補(bǔ)充評估并考慮重新設(shè)計(jì) (如有需要)。通常情況下，最好使用熱啟動 DNA 聚合酶，并在冰上進(jìn)行反應(yīng)。

5、在理論上，針對同一靶點(diǎn)應(yīng)同時(shí)檢測多個引物組。這實(shí)際上可以節(jié)省大量時(shí)間，因?yàn)槿绻@些引物中的一個能立即發(fā)揮作用，則可以減少花費(fèi)在優(yōu)化過程上的時(shí)間。