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上海斯邁歐分析儀器有限公司

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紫外-可見二極管陣列用于多波長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析的優(yōu)勢(shì)

2022-4-14  閱讀(423)

前言:采用分光光度法監(jiān)控反應(yīng)底物的減少或反應(yīng)產(chǎn)物的增加,可以跟蹤對(duì)-硝基苯基乙酸酯 (pNPA) 的水解反應(yīng)過(guò)程。監(jiān)控濃度變化的速率可以確定反應(yīng)的速率。Agilent Cary 8454 紫外-可見二極管陣列分光光度計(jì)只需 0.1 秒的時(shí)間就能夠獲得全光譜。您可以根據(jù)需要隨時(shí)從儲(chǔ)存的光譜數(shù)據(jù)中提取出隨時(shí)間變化的吸光度。由于包含整個(gè)波長(zhǎng)范圍的數(shù)據(jù)是在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)里同時(shí)獲得的,因此,可以對(duì)不同波長(zhǎng)的結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確的闡釋,為反應(yīng)機(jī)理的研究提供有用的信息。


采用傳統(tǒng)的掃描分光光度計(jì),通常能夠比較方便地在單一波長(zhǎng)或者選定的幾個(gè)波長(zhǎng)上跟蹤反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程,如果反應(yīng)非??焖伲瑒t使用分光光度計(jì)是必需的。對(duì)于 pNPA 的水解反應(yīng)過(guò)程,可以在 270 nm 下監(jiān)控 pNPA 的消耗或在405 nm 下監(jiān)控對(duì)-硝基生成。然而,由于沒(méi)有監(jiān)控整個(gè)光譜范圍,有可能漏掉實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確分析所必需的重要數(shù)據(jù)。除了快速、精確的測(cè)量,精確的溫度控制對(duì)于準(zhǔn)確的動(dòng)力學(xué)測(cè)量也是至關(guān)重要的。根據(jù)所研究的反應(yīng)不同,僅僅 1 °C 的變化就有可能導(dǎo)致觀測(cè)到的反應(yīng)速率發(fā)生重大變化。AgilentCary 8454 提供的帕爾貼溫度控制附件(部件號(hào) 89090A)可以精確控制溫度,能夠加熱或冷卻樣品,還能利用溫度探頭測(cè)量樣品的溫度。


實(shí)驗(yàn)部分:在堿性溶液中,pNPA 會(huì)按照下面的方程式水解為對(duì):

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從原理上講,這是一個(gè)二級(jí)反應(yīng),但如果存在過(guò)量的水,則會(huì)表現(xiàn)出偽一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。反應(yīng)速率對(duì) pH 值和溫度較為敏感。將 2.9 mL 的 0.1 M 磷酸緩沖液 (pH 8.5) 加入到比色皿中,然后將其放入恒溫的比色皿支架中使其達(dá)到平衡。樣品的精確溫度由一個(gè)外置溫度傳感器選件測(cè)定,該傳感器尺寸很小,有玻璃外罩以保持惰性。


環(huán)繞在樣品池周圍的鋁塊的溫度由帕爾貼溫度控制器控制。樣品池與鋁塊緊密接觸以盡可能減小溫度差異。預(yù)設(shè)溫度與樣品實(shí)際溫度之間只有很微小的差異。在比色皿中加入3 mL 蒸餾水,就可以用外置傳感器來(lái)測(cè)定不同溫度下二者之間的差異(圖 2)。盡管如此,監(jiān)控得到的溫度是通過(guò)外置傳感器測(cè)得的實(shí)際樣品的溫度,這就保證了最高的溫度精度。當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到平衡時(shí),將 50 µL 溶于無(wú)水乙腈的對(duì)-硝基苯基乙酸酯儲(chǔ)備液加入比色皿開始反應(yīng),并用攪拌器以700 rpm 的速度混合反應(yīng)物。以時(shí)間間隔自動(dòng)獲取譜圖,該時(shí)間間隔是根據(jù)反應(yīng)溫度和速度進(jìn)行調(diào)節(jié)。圖 3 顯示了 55 °C 時(shí)反應(yīng)體系的光譜,測(cè)量間隔為 125 秒。

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如果在一定的波長(zhǎng)范圍內(nèi)不斷重復(fù)記錄變化的吸收光譜,這些譜可能在一個(gè)或多個(gè)波長(zhǎng)處發(fā)生交叉(圖 3)。這些交叉點(diǎn)稱為等消光點(diǎn),它表示反應(yīng)物與產(chǎn)物之間發(fā)生的是單相反應(yīng)(也就是沒(méi)有副反應(yīng)或串連反應(yīng))。圖 3 所顯示出的精確的等消光點(diǎn)表明了 Agilent Cary 8454 紫外-可見分光光度計(jì)在整個(gè)反應(yīng)時(shí)間里的光學(xué)和溫度穩(wěn)定性。


采用紫外-可見光化學(xué)工作站,您可以很容易地打開已經(jīng)收集保存的數(shù)據(jù)并在任意波長(zhǎng)內(nèi)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行重新分析。在這個(gè)例子中,在數(shù)據(jù)采集完成后,可以提取出單波長(zhǎng) (405 nm)下對(duì)-硝基生成過(guò)程的數(shù)據(jù)以獲得反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在這個(gè)波長(zhǎng)下,沒(méi)有其他組分的吸收(圖 4)。采用紫外-可見光化學(xué)工作站軟件中的動(dòng)力學(xué)模式計(jì)算得到的 55 °C 時(shí)的偽一級(jí)速率常數(shù)為 1.24 x 10-3 s-1。這種動(dòng)力學(xué)模式是生化分析附加模塊 (G1117AA) 的組成部分。

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結(jié)論Agilent Cary 8454 可見-紫外光分光光度計(jì)是酶催化反應(yīng)或化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析的理想工具。本文展示了帕爾貼溫度附件在反應(yīng)溫度可靠控制方面的有效性,它使得儀器在整個(gè)動(dòng)力學(xué)分析期間具有穩(wěn)定性。二極管陣列分光光度計(jì)具有許多優(yōu)點(diǎn),其全光譜采樣時(shí)間僅僅只需 0.1 秒。全光譜采集功能讓用戶能夠獲得反應(yīng)相關(guān)的所有數(shù)據(jù)。它能讓用戶在數(shù)據(jù)采集之后方便快捷地在任何波長(zhǎng)下對(duì)反應(yīng)速率進(jìn)行處理。另一方面,通過(guò)監(jiān)控一定的波長(zhǎng)范圍,光譜可用于多組分分析以確定在各個(gè)測(cè)量時(shí)間點(diǎn)反應(yīng)底物和產(chǎn)物的濃度。

 




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