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液體樣本甘油酶法測(cè)定試劑盒的原理
2023-11-30 閱讀(285)
液體樣本甘油酶法測(cè)定試劑盒的原理
描述：甘油是甘油三酯的水解產(chǎn)物。脂蛋白酯酶能夠水解血
液中的甘油三酯；胰脂酶可以水解食物中的甘油三酯；激素
敏感脂肪分解酶能夠水解脂肪細(xì)胞中的甘油三酯。與游離脂
肪酸一樣，甘油含量是甘油三酯水解反應(yīng)的可靠檢測(cè)指標(biāo)，
但檢測(cè)更加方便。本試劑盒采用甘油磷酸氧化酶法與經(jīng)典的
GPO-Trinder 酶學(xué)反應(yīng)方法，通過(guò)比色測(cè)定液體樣本中的甘
油含量。經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，操作步驟更加簡(jiǎn)單，檢測(cè)線(xiàn)性范圍在
10-1200µmol/L，可靠性和重復(fù)性俱佳，適合生物醫(yī)學(xué)、食
品實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。
原理：在 ATP 存在下甘油被甘油激酶磷酸化為 3-磷酸甘油，
再被甘油磷酸氧化酶氧化產(chǎn)生過(guò)氧化氫；在過(guò)氧化物酶作用
下生色底物轉(zhuǎn)化為苯醌亞胺，其光密度值與甘油濃度成正
比。
適用范圍：測(cè)定血液、細(xì)胞培養(yǎng)基、體液、酒類(lèi)飲料中的甘
油濃度。
組成 ：（以 250 次為例）
(1) R1 試劑 40 ml
(2) R2 試劑 10 ml
(3) 4 mmol/L 甘油標(biāo)準(zhǔn)品 1 ml
4 oC 保存，6 個(gè)月有效
所需設(shè)備：酶標(biāo)儀、生化分析儀或 721、722 型可見(jiàn)光分光
光度計(jì)。最佳工作波長(zhǎng) 550nm，如無(wú)此波長(zhǎng)建議優(yōu)先選用
570nm、次選 530、490nm。
一 樣本處理：
1. 酒類(lèi)、飲品、清澈液體樣本：可直接進(jìn)行測(cè)定，如超過(guò)
線(xiàn)性范圍可用蒸餾水或生理鹽水稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。
2. 培養(yǎng)液：取不含酚紅、無(wú)顏色、無(wú)血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，
如有細(xì)胞碎片應(yīng) 4oC,，12,000g 離心 5min,取上清進(jìn)行測(cè)
定。
3. 血液：對(duì)于新鮮抗凝血而言，可 4oC，2,000g 離心 5min
得到血漿；而對(duì)于非抗凝血來(lái)說(shuō)，可先 4oC 靜置 2h 得
到血清后，2000g 離心 10min,除去血細(xì)胞。將得到的血
漿/血清 70oC 加熱 10 分鐘滅活內(nèi)源脂肪酶，12,000g
離心 10min ,去上清進(jìn)行測(cè)定或-20oC 保存。
二 工作溶液配制：按 4:1 比例，取 4 ml 試劑 R1 與 1 ml 試
劑 R2 混合即可，立即使用或 4oC 保存<1 天，變色棄去。
三 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋?zhuān)?/span>用蒸餾水、生理鹽水或與樣品緩沖液一致
的液體，將 4 mM 甘油標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋為 1000、500、
250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 µmol/L，通常
取其中 4~6 管即可，注意設(shè)置 0 濃度對(duì)照反應(yīng)管。
四 甘油濃度測(cè)定：
1. 參見(jiàn)下表進(jìn)行加樣。為使反應(yīng)時(shí)間盡量一致，減小實(shí)驗(yàn)
誤差，可先加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品，然后再加入工作溶
液。（注意：當(dāng)甘油濃度較低時(shí)，可將待測(cè)樣品與工作
溶液按照 100µl:100µl 體積進(jìn)行混合，然后再進(jìn)行測(cè)定，
但是如果樣品體積超過(guò) 100µl 時(shí)將會(huì)稀釋工作液中酶
的濃度，致使反應(yīng)靈敏度下降。如果待測(cè)樣品濃度超過(guò)
線(xiàn)性范圍的時(shí)候，可進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)缓蟾鶕?jù)稀釋倍數(shù)
來(lái)計(jì)算樣品中甘油濃度。）
2. 37oC 或 25oC 反應(yīng) 15 分鐘。反應(yīng)平衡后顏色在 60 分鐘
內(nèi)穩(wěn)定。
3. 先用蒸餾水+工作液的空白管調(diào)零，然后測(cè)定各管 OD
值。
4. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并計(jì)算甘油濃度。
附 Excel 作圖步驟：各標(biāo)準(zhǔn)管 OD 值為 y 軸，標(biāo)準(zhǔn)品濃
度為 x 軸。(1)鼠標(biāo)左鍵圈住數(shù)據(jù)，點(diǎn)擊做圖向?qū)Вx
擇-散點(diǎn)圖-，點(diǎn)擊-完成-。(2)鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)圖上的某一
點(diǎn)，點(diǎn)擊-添加趨勢(shì)線(xiàn)-，點(diǎn)擊-選項(xiàng)-，點(diǎn)擊-顯示公式-
和-R 2值-。
表一：
酶標(biāo)微板測(cè)定的加樣比例（檢測(cè)范圍 10-1200µmol/L）
（可對(duì)樣品和工作液比例進(jìn)行微量調(diào)整）
液體樣本甘油酶法測(cè)定試劑盒的原理
