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南京億迅生物科技有限公司
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原位雜交實驗郵寄樣本的注意事項
2023-10-26 閱讀(313)
原位雜交實驗郵寄樣本的注意事項
原位雜交已成為當(dāng)今細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、病理學(xué)研究的重要手段。
信帆生物，可進(jìn)行mRNA, lncRNA, circRNA, micRNA等各類RNA分子和DNA的原位雜交檢測。
可接收石蠟切片、冰凍切片、細(xì)胞爬片等實驗樣本，可以做DAB，NBT，熒光單標(biāo)，雙標(biāo)，三標(biāo)等不同顯色系統(tǒng)的檢測。
原位雜交實驗的送樣要求
1、切片前處理要求
新鮮組織干冰運(yùn)輸后做冰凍切片；或取2mm左右厚度的新鮮組織，5min內(nèi)投入原位雜交固定液內(nèi)固定，4℃低溫保存運(yùn)輸，切勿冷凍結(jié)冰；盡快包埋切片后進(jìn)行原位雜交實驗，固定時間過長影響核酸檢出率；
2、冰凍切片
冰凍切片-20℃運(yùn)輸；
3、石蠟切片
石蠟切片常溫運(yùn)輸；
4、 細(xì)胞爬片
細(xì)胞爬片加原位雜交固定液固定15min后，換無酶PBS，密封，4℃運(yùn)輸。
石蠟切片 熒光原位雜交 實驗流程
下面以石蠟切片熒光原位雜交為例來具體介紹一下原位雜交的實驗流程(具體實驗參數(shù)可根據(jù)實驗需求進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化)。
1石蠟切片脫蠟至水
依次將切片放入環(huán)保型脫蠟透明液Ⅰ(貨號G1128，15 min)-環(huán)保型脫蠟透明液Ⅱ(貨號G1128，15 min)-無水乙醇Ⅰ(5 min)-無水乙醇Ⅱ(5 min)-85%酒精(5 min)-75%酒精(5 min)-無酶水(貨號：G4700)。
2修復(fù)
組織切片浸沒于1×修復(fù)液(貨號：G1202)中，加熱修復(fù)(如用微波爐加熱，可中火7分鐘，?；?分鐘，中低火6分鐘)。
3消化
組化筆(貨號：G6100)畫圈，將蛋白酶K(貨號G1234)稀釋至20μg/mL滴加到組織上，再放入恒溫箱40℃消化20-30min，接著用無核酸酶PBS緩沖液(貨號：G4202)洗3次，每次5min(最優(yōu)消化條件需根據(jù)實際實驗情況進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整，以獲得最佳實驗效果)。
4預(yù)雜交
輕輕甩干切片，滴加40℃預(yù)熱的雜交液覆蓋組織，放入恒溫箱40℃孵育30 min。
5雜交1
倒掉雜交液，滴加60 μL 40℃預(yù)熱的探針混合物1雜交液，水平置于濕盒再放入恒溫箱40℃孵育3h。(注意防止干片。做多標(biāo)時可同時添加不同靶標(biāo)的探針混合物1進(jìn)行雜交。賽維爾生物提供探針合成服務(wù))
6雜交后洗滌
倒掉雜交液，將切片依次用40℃預(yù)熱的2× SSC、1× SSC、0.5× SSC、0.1× SSC(20×SSC緩沖液，貨號：G3015，用無核酸酶水稀釋)各漂洗5 min(如非特異性雜交體較多，可以在此步增加洗滌時間、次數(shù)及調(diào)整雜交液中甲酰胺濃度)。
7雜交2
輕輕甩干切片，滴加60 μL 40℃預(yù)熱的探針混合物2雜交液，水平置于濕盒再放入恒溫箱40℃雜交45 min(此過程中可在濕盒底部加入50ml 2× SSC，防止干片。做多標(biāo)時可同時添加不同靶標(biāo)的探針混合物2進(jìn)行雜交)。
8雜交后洗滌
同第6步
9信號雜交
輕輕甩干切片，滴加60 μL 40℃預(yù)熱的信號探針雜交液，水平置于濕盒再放入恒溫箱40℃雜交45 min(此過程中可在濕盒底部加入50ml 2× SSC，防止干片。做多標(biāo)時可同時添加不同信號探針進(jìn)行雜交)。
10雜交后洗滌
同第6步
根據(jù)不同的信號探針，選用不同的顯色系統(tǒng)，本次是熒光探針，所以進(jìn)行DAPI染色：
11DAPI染核
切片用無核酸酶的PBS緩沖液(貨號：G4202)潤洗，切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染色試劑(貨號：G1012)，避光室溫孵育8 min。
12封片
切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑(貨號：G1401)封片。
13圖像采集分析
最后進(jìn)行鏡檢拍照，或熒光共聚焦拍照(可選)，或切片掃描(可選)。
原位雜交實驗郵寄樣本的注意事項
