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RT-PCR反應(yīng)體系靈敏度提高方法
2022-8-1 閱讀(326)
逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。
提高RT-PCR反應(yīng)體系的靈敏度幾個(gè)方法：
1、分離高質(zhì)量RNA
成功的cDNA合成來自高質(zhì)量的RNA。高質(zhì)量的RNA應(yīng)保-證全長并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑如EDTA或SDS等，以及盡可能減少基因組DNA污染。RNA的質(zhì)量決定了你能夠轉(zhuǎn)錄到cDNA上的序列信息量的大值。
2、使用無RNaseH活性的逆轉(zhuǎn)錄酶
在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。不管是M-MLV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內(nèi)源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，并降解RNA：DNA復(fù)合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的產(chǎn)量和長度。因此消除或大大降低逆轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH活性將會(huì)大有裨益。
3、提高逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度
較高的保溫溫度有助于RNA二結(jié)構(gòu)的打開，增加了反應(yīng)的產(chǎn)量。對(duì)于多數(shù)RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65℃保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數(shù)二結(jié)構(gòu)，從而使引物可以結(jié)合。
4、促進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄的添加劑
包括甘油和DMSO在內(nèi)的添加劑加到*鏈合成反應(yīng)中，可以減低核酸雙鏈的穩(wěn)定并解開RNA二結(jié)構(gòu)，多可以加入20％的甘油或10％的DMSO而不影響SuperScriptⅡ或M-MLV的活性。AMV也可以耐受多20％的甘油而不降低活性。
5、RNaseH處理
在PCR之使用RNaseH處理cDNA合成反應(yīng)可以提高靈敏度。對(duì)于某些模板，在cDNA合成反應(yīng)中的RNA會(huì)阻止擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合，在這種情況下，RNaseH處理可以增加靈敏度。一般當(dāng)擴(kuò)增較長的全長cDNA目標(biāo)模板時(shí)，RNaseH處理是必需的，比如低拷貝的tuberous scherosisⅡ。對(duì)這種困難模板，RNaseH的處理加強(qiáng)了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所產(chǎn)生的信號(hào)。對(duì)于多數(shù)RT-PCR反應(yīng)，RNaseH處理是可選的，因?yàn)?5℃保溫的PCR變性步驟一般會(huì)將RNA：DNA復(fù)合物中的RNA水解掉。
6、小量RNA檢測方法的提高
當(dāng)僅有小量RNA時(shí)，RT-PCR尤其具有挑戰(zhàn)性。在RNA分離過程中加入的作為載體的糖元有助于增加小量樣品的產(chǎn)量。可以在加入Trizol的同時(shí)加入無RNase的糖元。對(duì)于小于50mg的組織106個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞的樣品，無RNase糖元的建議濃度為250μg/ml。在使用SuperScriptⅡ的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中加入乙?；疊SA可以增加靈敏度，而且對(duì)于小量RNA，減少SuperScriptⅡ的量并加40單位的RnaseOut核酸酶抑制劑可以提高檢測的水平。如果在RNA分離過程中使用了糖元，仍然建議在使用SuperScriptⅡ進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)加入BSA或RNase抑制劑。
7、減少基因組DNA污染
RT-PCR所遇到的一個(gè)潛在的困難是RNA中有基因組DNA污染，可以在逆轉(zhuǎn)錄之使用擴(kuò)增的DNaseⅠ對(duì)RNA進(jìn)行處理以除去沾染的DNA。將樣品在2.0mM EDTA中65℃保溫10分鐘以終止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合鎂離子，防止高溫時(shí)所發(fā)生的依賴于鎂離子的DNA水解。為了將擴(kuò)增的cDNA同沾染的基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物分開，可以設(shè)計(jì)分別同分開的外顯子退火的引物。來源于cDNA的PCR產(chǎn)物會(huì)比來源于污染的基因組DNA的產(chǎn)物短。另外對(duì)每個(gè)RNA模板進(jìn)行一個(gè)無逆轉(zhuǎn)錄的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以確定一個(gè)給定片段是來自基因組DNA還是cDNA。在無逆轉(zhuǎn)錄時(shí)所得到的PCR產(chǎn)物來源于基因組。
