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大鼠凋亡相關(guān)因子配體（FASL） ELISA Kit現(xiàn)貨代測(cè) 測(cè)定

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樣品如果不立即分析，應(yīng)分裝后冷凍保存，且避免反復(fù)凍融。

血清——用干凈試管收集血液，室溫凝固2小時(shí)或4℃過夜，離心1000×g 10分鐘，收集血清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。

細(xì)胞培養(yǎng)、組織勻漿、體液——離心去除沉淀，立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。

大鼠凋亡相關(guān)因子配體(FASL) ELISA Kit現(xiàn)貨代測(cè) 測(cè)定 結(jié)果判斷1、定性測(cè)定定性測(cè)定的結(jié)果判斷是對(duì)受檢標(biāo)本中是否含有待測(cè)抗原或抗體作出"有"或"無"的簡(jiǎn)單回答，分別用"陽性"、"陰性"表示。"陽性"表示該標(biāo)本在該測(cè)定系統(tǒng)中有反應(yīng)。"陰性"則為無反應(yīng)。用定性判斷法也可得到半定量結(jié)果，即用滴度來表示反應(yīng)的強(qiáng)度，其實(shí)質(zhì)仍是一個(gè)定性試驗(yàn)。在這種半定量測(cè)定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)，呈陽性反應(yīng)的zui高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽性、弱陽性更具定量意義。在間接法和夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競(jìng)爭(zhēng)法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔。兩類反應(yīng)的結(jié)果判斷方法不同，分述于下。（1）間接法和夾心法這類反應(yīng)的定性結(jié)果可以用肉眼判斷。目視標(biāo)本也無色或近于無色者判為陰性，顯色清晰者為陽性。但在ELSIA中，正常人血清反應(yīng)后?？沙霈F(xiàn)呈色的本底，此本底的深淺因試劑的組成和實(shí)驗(yàn)的條件不同而異，因此實(shí)驗(yàn)中必須加測(cè)陰性對(duì)照。陰性對(duì)照的組成應(yīng)為不含受檢物的正常血清或類似物（見3.6）。在用肉眼判斷結(jié)果時(shí)，更宜用顯色深于陰性對(duì)照作為標(biāo)本陽性的指標(biāo)。目視法簡(jiǎn)捷明了，但頗具主觀性。在條件許可下，應(yīng)該用比色計(jì)測(cè)定吸光值，這樣可以得到客觀的數(shù)據(jù)。先讀出標(biāo)本（sample，S）、陽性對(duì)照（P）、和陰性對(duì)照（N）的吸光值，然后進(jìn)行計(jì)算。計(jì)算方法有多種，大致可分為陽性判定值法和標(biāo)本與陰性對(duì)照比值法兩類。a．陽性判定值陽性判定值（cut-off value）一般為陰性對(duì)照A值加上一個(gè)特定的常數(shù)，以此作為判斷結(jié)果陽性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)。用此法判斷結(jié)果要求實(shí)驗(yàn)條件十分恒定，試劑的制備必須標(biāo)準(zhǔn)化，陽性和陰性的對(duì)照品應(yīng)符合一定的規(guī)格，須配用精密的儀器，并嚴(yán)格按規(guī)定操作。陽性判定值公式中的常數(shù)是在這特定的系統(tǒng)中通過對(duì)大量標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)而得到的?，F(xiàn)舉某種檢測(cè)HBsAg的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對(duì)照品為不含HBsAg的復(fù)鈣人血漿，陽性對(duì)照品HBsAg的含量標(biāo)明為P=9±2ng/ml.每次試驗(yàn)設(shè)2個(gè)陽性對(duì)照和3個(gè)陰性對(duì)照。測(cè)得A值后，先計(jì)算陰性對(duì)照A值的平均數(shù)（NCX）和陽性對(duì)照A值的平均數(shù)（PCX），兩個(gè)平均數(shù)的差（P-N）必須大于一個(gè)特定的數(shù)值（例0.400），試驗(yàn)才有效。3個(gè)陰性對(duì)照A值均應(yīng)≥0.5×NCX，并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而已另兩個(gè)陰性對(duì)照重新計(jì)算NCX如有兩個(gè)陰性對(duì)照A值超出以上范圍，則該次實(shí)驗(yàn)無效。陽性判定值按下式計(jì)算：陽性判定值=NCX+0.05　標(biāo)本A值＞陽性判定值的為陽性，小于陽性判定值的為陰性。應(yīng)注意的是，式中0.05為該試劑盒的常數(shù)，只適合于該特定條件下，而不是對(duì)各種試劑均可通用。根據(jù)以上敘述可以看出，在這種方法中陰性對(duì)照和陽性對(duì)照也起到試驗(yàn)的質(zhì)控作用，試劑變質(zhì)和操作不當(dāng)均會(huì)產(chǎn)生"試驗(yàn)無效"的后果。b.標(biāo)本/陰性對(duì)照比值在實(shí)驗(yàn)條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標(biāo)本（S）和陰性對(duì)照（N）的A值后，計(jì)算S/N值。也有寫作P/N的，這里的P不代表陽性(positive)，而是病人（patient）的縮寫，不應(yīng)誤解。為避免混淆，更宜用S/N表示。在早期的間接法ELISA中，有些作者定出S/N為陽性標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)多為各種測(cè)定所沿用。實(shí)際上每一測(cè)定系統(tǒng)應(yīng)該用實(shí)驗(yàn)求出各自的S/N的閾值。更應(yīng)注意的是，N所代表的陰性對(duì)照是不含受檢物質(zhì)的人血清。有的試劑盒中所設(shè)陰性對(duì)照為不含蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)含量較底的緩沖液，以致反應(yīng)后產(chǎn)生的本底可能較正常人血清的本底低得多。因此，這類試劑盒規(guī)，如N<0.05（或其他數(shù)值），則按0.05計(jì)算，否則將出現(xiàn)假陽性結(jié)果。（2）競(jìng)爭(zhēng)法在競(jìng)爭(zhēng)法ELISA中，陰性孔呈色深于陽性孔。陰性呈色的強(qiáng)度取決于反應(yīng)中酶結(jié)合物的濃度和加入競(jìng)爭(zhēng)抑制物的量，一般調(diào)節(jié)陰性對(duì)照的吸光度在1.0-1.5之間，此時(shí)反應(yīng)zui為敏感。競(jìng)爭(zhēng)法ELISA不易用自視判斷結(jié)果，因肉眼很難辨別弱陽性反應(yīng)與陰性對(duì)照的顯色差異，一般均用比色計(jì)測(cè)定，讀出S、P和N的吸光值。計(jì)算方法主要也有兩種，即陽性判定值法和抑制率法。a. 陽性判定值法與間接法和夾心法中的陽性判定值法基本相同，但在計(jì)算公式中引入陽性對(duì)照A值，現(xiàn)舉某種檢測(cè)抗HBc的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對(duì)照為不含抗HBc的復(fù)鈣人血漿，陽性對(duì)照中抗HBc含量為125±100u/ml.每次試驗(yàn)設(shè)2個(gè)陽性對(duì)照和3個(gè)陰性對(duì)照。測(cè)得A值后，先計(jì)算陰性對(duì)照A值的平均值（NCX）和陽性對(duì)照A值的平均數(shù)（PCX），兩個(gè)平均數(shù)的差（N-P）必須大于一個(gè)特定的數(shù)值（例如0.300），試驗(yàn)才有效。3個(gè)陰性對(duì)照A值均應(yīng)小于2.000，而且應(yīng)≥0.5×NCX并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而以另2個(gè)陰性對(duì)照重新計(jì)算×NCX如有2個(gè)陰性對(duì)照A超出以上范圍，則該次實(shí)驗(yàn)無效。陽性判定值按下式計(jì)算：陰性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX2、定量測(cè)定ELISA操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達(dá)到各個(gè)體之間的*，因此在定量測(cè)定中，每批測(cè)試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，曲線zui高點(diǎn)的吸光度可接近2.0，繪制時(shí)常用半對(duì)數(shù)紙，以檢測(cè)物的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，將各濃度的值逐點(diǎn)連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，*較呈直線的部分是的檢測(cè)區(qū)域。甲胎蛋白質(zhì)ELISA測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線示例見圖4-1。測(cè)定小分子量物質(zhì)常用競(jìng)爭(zhēng)法，其標(biāo)準(zhǔn)曲線中吸光度與受檢物質(zhì)的濃度呈負(fù)相關(guān)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的形狀因試劑盒所用模式的差別而略有不同。ELISA測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線示例見圖4-2.注意圖中橫坐標(biāo)為對(duì)數(shù)關(guān)系，這更有利于測(cè)定系統(tǒng)的表達(dá)。新型酶標(biāo)儀一般帶有自動(dòng)軟件可進(jìn)行定量分析。

大鼠凋亡相關(guān)因子配體(FASL) ELISA Kit現(xiàn)貨代測(cè) 測(cè)定 保溫在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育，在ELISA中似不恰當(dāng)。ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì)，只有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育。溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。在建立ELISA方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時(shí)，產(chǎn)物的生成可達(dá)。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗(yàn)在43℃進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應(yīng)4℃更為*，在放射免疫測(cè)定中多使反應(yīng)在冰箱中過夜，以形成zui多的沉淀。但因所需時(shí)間太長(zhǎng)，在ELISA中一般不予采用。保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴，可將ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時(shí)可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，zui后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時(shí)候更應(yīng)如此。無論是水浴還是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng)，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時(shí)可根據(jù)說明書的要求控制溫育。室溫溫育時(shí)，ELISA板只要平置于操作臺(tái)上即可。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。

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