細(xì)胞：ST細(xì)胞

中文名稱：豬胎睪丸細(xì)胞

生長特性：貼壁細(xì)胞

ST細(xì)胞培養(yǎng)基：DMEM-H +10%FBS（GIBCO胎牛血清）

凍存條件：50%基礎(chǔ)培養(yǎng)基、40% FBS、10% DMSO

收到細(xì)胞后請盡快更換配套培養(yǎng)基，或自己配置的新鮮培養(yǎng)基（含15%血清），如因特殊情況需要繼續(xù)使用原瓶培養(yǎng)基，請?jiān)谠颗囵B(yǎng)基中額外添加10%的血清（原瓶培養(yǎng)基的繼續(xù)使用時(shí)間最長不宜超過72小時(shí)）。

ST細(xì)胞傳代：

1）：細(xì)胞密度約80%時(shí)，吸出原培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，PBS緩沖液潤洗細(xì)胞兩次，加2~3 ml 0.25% yi酶進(jìn)行消化細(xì)胞（注意根據(jù)實(shí)際情況，把握消化時(shí)間）。

2）：鏡下觀察消化情況，在細(xì)胞邊緣縮小，貼壁松動時(shí)；

（可用吸管吸起些許yi酶輕輕吹打細(xì)胞層某處，即可肉眼可見細(xì)胞層脫落，或吹打后鏡下觀察吹打處，即消化完成，否則繼續(xù)消化）

直接吸掉yi酶，加3~4ml 培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞層，把細(xì)胞層吹落，吹散。

3）：取部分細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中，添加適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，把細(xì)胞懸液打勻，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4）：注意培養(yǎng)基PH值變化情況，定期換液（每周2-3次），待細(xì)胞密度達(dá)到80%以后重復(fù)1項(xiàng)操作或者凍存。

（網(wǎng)絡(luò)信息主針對網(wǎng)絡(luò)推廣作用，僅供參考，細(xì)胞培養(yǎng)請咨詢細(xì)胞庫管理員，以細(xì)胞庫管理員提供給您的信息為準(zhǔn)，操作前，如果有不明白之處，先咨詢細(xì)胞庫管理員，避免不必要的損失；）

流行性乙型腦炎病毒(JEV)核酸擴(kuò)增檢測

【使用方法】

1．RNA提取

1.1樣品處理

淋巴結(jié)等固體組織：取50mg左右組織用玻璃勻漿器勻漿或剪刀剪碎，加入500μl RNA提取液A（Trizol reagents），研磨或振蕩至勻漿狀，轉(zhuǎn)移到1.5ml的EP管中，室溫放置5min。

腦脊液、血清或病毒液：取100μl血清或病毒液加入500μl RNA提取液A（Trizol reagents）充分震蕩，室溫放置5min。

1.2.加入100μl氯仿，用力震蕩15s，室溫靜置5min， 4℃ 13,000rpm離心5min。

1.3.小心將上層水相轉(zhuǎn)移到干凈離心管中，加300 μl 無水乙醇，另加10μl RNA提取液B（內(nèi)含不溶物，使用前室溫溶解并充分混勻），充分混勻，13,000rpm離心1min。

1.4.棄上清，加入500 μl 75%的DEPC乙醇，充分混勻，13,000rpm離心1min，小心吸去大部分乙醇。

1.5.將提取管敞口在室溫空氣中干燥5min待乙醇揮發(fā)干凈，用20µl DEPC H2O溶解沉淀。

陰性質(zhì)控品：取100μl陰性質(zhì)控品加入500μl RNA提取液A（Trizol reagents）充分震蕩，室溫放置5min。后按1.2~1.5操作。

JEV陽性質(zhì)控品：直接取4μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。或按照PCR擴(kuò)增所述方法進(jìn)行定量分析。

2 . 逆轉(zhuǎn)錄

根據(jù)標(biāo)本數(shù)取200μl DEPC水處理的PCR反應(yīng)管，取出JEV RT MIX室溫溶解充分混勻，向反應(yīng)管中每管加入7μl  JEV RT MIX，1μl逆轉(zhuǎn)錄酶系(使用前請10,000rpm瞬時(shí)離心30s)， 以及2μl 上述獲得的RNA。1,0000rpm瞬時(shí)離心30秒，將各反應(yīng)管放入PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，在PCR儀上進(jìn)行以下循環(huán)：30℃ 5分鐘，42℃30分鐘后98℃5分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。