一、制片

選無自發(fā)性熒光的石英玻片或普通玻片，洗凈后浸泡于無水乙醇和乙醚等量混合液中。用時取出用綢布擦凈。將待檢樣品如組織塊剪成適當(dāng)大小印壓于玻片上。也可采用冰凍切片或石蠟切片樣品。
二、固定

除研究細(xì)胞表面抗原或不穩(wěn)定抗原可不固定外，一般均應(yīng)固定。
固定的作用有三：
1.  防止標(biāo)本從玻片上脫落。
2.  除去防礙抗原-抗體結(jié)合的類脂，使抗原抗體結(jié)合物易于獲得良好的染色結(jié)果。
3.  固定的標(biāo)本易于保存，如組織切片固定后在-20℃下可保存一年而不改變其染色特性。

標(biāo)本的固定原則是：
1.  不能損傷細(xì)胞內(nèi)的抗原。
2.  不能凝集蛋白質(zhì)。
3.  不能損傷細(xì)胞形態(tài)。
4.  固定后應(yīng)保持細(xì)胞膜的通透性，以允許抗體進(jìn)入與抗原結(jié)合。
三、水洗

固定后以冷的0.01 Mol/L pH7.4PBS液浸泡沖洗，zui后以蒸餾水沖洗，防止自發(fā)性熒光。
四、染色

染色分直接染色法與間接染色法。

1.  材料與試劑

（1）熒光抗體，稀釋至應(yīng)用濃度。

（2）0.01 Mol/L pH7.4PBS液

（3）9份甘油加1份pH7.4PBS液即為甘油緩沖液。甘油有減少非特異性熒光的作用。

（4）帶蓋方盤

2.  直接染色法

（1）將固定好的玻片置于濕盤中，滴加熒光抗體染色液，以覆蓋為度，加蓋，37℃感做30 min~45min。

（2）PBS沖洗3次，每次沖洗3 min，即3×3沖洗。

（3）蒸餾水沖洗。

（4）滴甘油緩沖液一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。

3.  間接染色法

（1） 檢查抗原：
①取固定標(biāo)本，加已知的免疫血清，37℃孵育30 min。
②以PBS液3×3沖洗。
③再加熒光標(biāo)記的抗抗體，37℃孵育30http://www.hg1112.cn/st546307/list_793909.html min。
④PBS 3×3沖洗。
⑤H2O沖洗，涼干。
⑥加甘油緩沖液，封片、鏡檢。

（2）檢查抗體：
①免疫后動物的淋巴組織涂片，自然干燥，甲醇固定。
②滴加相應(yīng)抗原液（按1：100~1：500稀釋），37℃孵育30 min。
③PBS液3×3沖洗。
④加熒光抗體，37℃孵育30 min。
⑤PBS液3×3沖洗。
⑥水洗，涼干。
⑦加甘油緩沖液，封片、鏡檢。