子科生物報道：北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院高寧研究組與卡耐基梅隆大學(xué)的 John L. Woolford Jr. 研究組合作在Nature Communications雜志分別發(fā)表題為 “Coupling of 5S RNP rotation with maturation of functional centers during large ribosomal subunit assembly” 和 “Structural insights into assembly of the ribosomal nascent polypeptide exit tunnel” 的研究論文，報道了真核核糖體大亞基在細胞核中的多個高分辨的前體結(jié)構(gòu)，揭示了核糖體大亞基功能中心在細胞核內(nèi)的組裝機制以及它們之間的關(guān)聯(lián)。

真核核糖體的組裝是一個極其復(fù)雜又高度分級的過程，涉及核糖體 RNA（rRNA）的轉(zhuǎn)錄，修飾，加工和折疊以及核糖體蛋白質(zhì)的結(jié)合。在高等真核生物中，有超過300種因子參與核糖體的組裝，從而保證核糖體的生成準確而高效地進行。

核糖體的組裝與細胞的生長、增殖和分化密切相關(guān)，研究表明人類細胞中參與核糖體組裝過程的蛋白發(fā)生突變會導(dǎo)致組織特異性缺陷的人類疾病，統(tǒng)稱為核糖體病變（ribosomopathy）。例如先天性再生障礙性貧血癥（DBA, Diamond-Blackfan anemia）臨床表現(xiàn)為貧血、低網(wǎng)織紅細胞計數(shù)、巨紅細胞以及胎兒血紅蛋白表達增加和腺苷脫氨酶活性升高，是由于多種編碼核糖體蛋白的基因突變所造成的，包括RPS19、RPL5和RPL11等。此外，當核糖體組裝出現(xiàn)錯誤時，游離的5S RNP（CP 的組成部分）會與腫瘤抑制因子p53的抑制子MDM2結(jié)合，并將其隔離在核仁中，導(dǎo)致p53激活，細胞周期停滯并zui終導(dǎo)致細胞凋亡。

得益于冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展，以酵母為模式生物，真核核糖體前體的多個不同狀態(tài)的高分辨結(jié)構(gòu)獲得了解析。盡管擁有如此豐富的結(jié)構(gòu)信息，但是領(lǐng)域?qū)τ诤颂求w的重要功能中心的組裝以及它們之間在組裝時是否存在偶聯(lián)還知之甚少，此外對于大部分組裝因子的具體分子功能尚待探索。核糖體大亞基的功能模塊包括中央凸起（CP, central protuberance）、肽基轉(zhuǎn)移酶中心（PTC, peptidyl transferase center）以及新生肽鏈出口隧道（NPET, nascent polypeptide exit tunnel），這些功能中心在進化上是高度保守的。

真核核糖體大亞基的前體從核仁到核質(zhì)的組裝過程中，結(jié)構(gòu)會發(fā)生一些列的重大重組，其中包括組成CP的 5S RNP 的旋轉(zhuǎn)、組成PTC的 rRNA螺旋H68-71的構(gòu)象轉(zhuǎn)換，以及組裝因子 的C端探入并結(jié)合NPET。

本研究結(jié)合分子遺傳學(xué)，生物化學(xué)以及冷凍電鏡技術(shù)深入的研究了與CP PTC、NPET 組裝相關(guān)的組裝因子的功能，包括Rpf2、Sda1、以及核糖體蛋白uL4。通過一個組裝因子 Nog2 作為誘餌，在其 C 端加入親和標簽，從 rpf2△255-344突變體、Sda1-depletion 突變體、rpl4Δ63-87突變體以及 Δ595-647 rei1Δ341-393 reh1Δ380-432三突變體中親和純化出多個細胞核時期的大亞基前體的內(nèi)源復(fù)合物。進一步通過定量質(zhì)譜和冷凍電鏡表征了這些前體復(fù)合物的組成和結(jié)構(gòu)。

實驗結(jié)果表明，早期RNA構(gòu)象成熟可以作為結(jié)構(gòu)檢查點，指導(dǎo)組裝進入下一個步驟，例如Rpf2 CTD的缺失會使得rRNA螺旋 H68-70處于不正常的中間狀態(tài)，從而進一步影響了5S RNP 的旋轉(zhuǎn)以及 PTC 和 NPET 的組裝。作者提出 Rpf2-Rrs1 復(fù)合體穩(wěn)定錨定到核糖體大亞基前體，幫助 H68-70 的正確折疊是核糖體大亞基組裝過程中的一個關(guān)鍵質(zhì)量控制檢驗點。在針對NPET組裝相關(guān)的和uL4的突變株研究中，作者發(fā)現(xiàn) NPET 的組裝與 5S RNP 的旋轉(zhuǎn)是通過 H74 相互偶聯(lián)的，H74 接收NPET組裝缺陷的信號并阻止CP區(qū)域的進一步成熟，并且通道結(jié)合蛋白uL4的突變會產(chǎn)生一系列的處于不同組裝階段的缺陷前體（很可能是turnover的中間體），表明NPET的組裝是前體核內(nèi)成熟中的一個重要質(zhì)量檢查點。

本項工作揭示了真核核糖體前體是如何感知 PTC 以及 NPET 的組裝缺陷并將其傳遞給其它區(qū)域，以及大亞基功能中心的組裝是如何關(guān)聯(lián)并相互影響的，為深入理解核糖體大亞基的組裝過程提供了重要的結(jié)構(gòu)線索。