組織切片伴隨著顯微鏡技術(shù)和免疫實驗等的發(fā)展已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)同和應(yīng)用。其中各種組織切片方法的操作步驟和應(yīng)用范圍各不相同，本文對其中的石蠟切片、蘇木精染色、結(jié)締組織染色等方法進行介紹。

(一)常規(guī)石蠟切片的制備：

(1)取材與固定：切取組織時應(yīng)使用鋒利的刀、剪，切取組織塊時，從刀的根部開始向后拉動切開組織。組織塊的厚度約為0.2~0.3cm，大小為1.5cm x 1.5cm x 0.3cm為宜。取好的組織塊用10%福爾馬林溶液固定24~48h。

(2)包埋：先經(jīng)梯度乙醇脫水后用二甲苯透明，然后入溶融的石蠟中浸透每次30min，共3次;再包埋。

(3)切片：包埋好的石蠟塊即可進行切片;切片的厚度為5μm左右。

(二)蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色方法：

(1)脫蠟：主要用二甲苯脫蠟。

(2)梯度乙醇水化。

(3)自來水沖洗。

(4)蘇木精染色：水化后的切片放入蘇木精染液中浸5~20min，染細(xì)胞核。自來水沖洗3~5min。

(5)1%鹽酸乙醇分化5~30s。自來水沖洗1~3min。

(6)弱堿性水溶液返藍30s~1min。自來水充分沖洗5~10分鐘。

(7)伊紅染色：充分水化后的切片直接入伊紅染色液中，染細(xì)胞質(zhì)5~15min左右。

(8)梯度乙醇脫水。

(9)二甲苯透明。

(10)中性樹膠封片。

二、組織化學(xué)及免疫組織化學(xué)技術(shù)

(一)組織化學(xué)(histochemistry)：一般稱為特殊染色，基本原理是通過應(yīng)用某些能與組織細(xì)胞化學(xué)成分特異性結(jié)合的顯色試劑，定位地顯示組織細(xì)胞的特殊化學(xué)成分并保持原有的形態(tài)學(xué)改變，對一些代謝性疾病的診斷具有一定的參考價值。通過光鏡或電鏡觀察，可以檢測組織切片內(nèi)的蛋白質(zhì)、糖類、脂類、酶類、核酸與某些金屬元素等。

1.過碘酸雪夫氏染色(periodic acid-schiff stain，PAS染色)：過碘酸是一種氧化劑，它能氧化糖類及有關(guān)物質(zhì)中的1.2乙二醇基使之變?yōu)槎?，醛與Schiff氏試劑結(jié)合，形成紅色的取代色素而得到定位。PAS染色可顯示糖原、中性黏液物質(zhì)、基底膜、軟骨、垂體、霉菌及寄生蟲等物質(zhì)。是廣泛應(yīng)用的染色方法。在腎小球腎炎時PAS染色可顯示基底膜和系膜區(qū)的改變。

染色方法：

(1)切片按常規(guī)脫蠟水洗，再用蒸餾水洗滌。

(2)0.5%~1%過碘酸水溶液氧化5~10min。

(3)蒸餾水充分洗滌，至少3次。

(4)Schiff氏試劑染10~30min。

(5)傾去染液后，直接用亞硫酸沖洗液處理切片3次，每次2 min，以達到分化。

(6)自來水沖洗5~10 min，使之顯現(xiàn)出紅色。然后蒸餾水洗1次。

(7)明礬蘇木精染核，自來水充分洗滌。

(8)95%乙醇及無水乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。

結(jié)果判定：PAS陽性物質(zhì)呈鮮紫紅色，其它組織淡粉紅色，細(xì)胞核呈淺藍色。

2.結(jié)締組織的染色方法

一般所說的結(jié)締組織是指纖維性結(jié)締組織而言，其結(jié)構(gòu)特點是細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)基質(zhì)外含有較多的纖維成分，主要是膠原纖維、彈性纖維和網(wǎng)狀纖維，我們僅簡述這三種纖維的常見染色方法。

(1)Mallory三色染色法：常用于判定多種組織、器官的病變程度及修復(fù)情況，區(qū)分腫瘤組織中的纖維成分與平滑肌。

染色步驟：

①中性甲醛液固定組織，石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。

②重鉻酸鉀液10min。

③蒸餾水沖洗2min，蒸餾水2次。

④酸性復(fù)紅液2min，蒸餾水稍洗。

⑤苯胺藍液20min，95%乙醇快速分化。

⑥直接用無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

結(jié)果判定：膠原和網(wǎng)狀纖維呈藍色。

(2)Van Gieson苦味酸酸性復(fù)紅法：可以顯示組織、器官的損傷、修復(fù)及硬化情況，特別是用于鑒別腫瘤組織中的膠原纖維與平滑肌纖維，可為診斷提供重要依據(jù)。

染色步驟：

①組織切片按常規(guī)脫蠟水洗。

②用Weigert蘇木素液染細(xì)胞核5~l0 min。

③自來水充分洗滌數(shù)分鐘。

④用顯微鏡檢查細(xì)胞核的著色程度，過深可用0.5%鹽酸乙醇分化。

⑤自來水洗至變藍;用蒸餾水洗。

⑥用Van Gieson液染1~5 min。

⑦傾去染液，直接用95%乙醇分化和脫水。

⑧無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

結(jié)果判定： 膠原纖維呈深粉紅色，肌纖維、胞漿及紅細(xì)胞黃色，細(xì)胞核呈棕黑色或蘭黑色。

(3)網(wǎng)狀纖維染色-Wider染色法：可以用來顯示病變組織網(wǎng)狀支架的破壞情況。特別是在腫瘤病理診斷中，網(wǎng)狀纖維染色對于鑒別來源于上皮組織和間葉組織的惡性腫瘤具有重要價值。

染色步驟：

①組織切片脫蠟至水。

10%②磷鉬酸，2~5min。蒸餾水沖洗，5min。

1%③硝酸鈾，5s。蒸餾水沖洗，10s。

④氧化銀溶液，5~10min。

95%⑤乙醇速洗，1~2s。

⑥還原液還原，1~2s。蒸餾水沖洗，2min。

0.2%⑦氯化金調(diào)色，2~20s。蒸餾水沖洗，5min。

5%⑧次亞硫酸鈉，2min。蒸餾水沖洗，2min。

⑨核固紅染細(xì)胞核，5~10min。水稍洗。

⑩常規(guī)無水乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。

結(jié)果判定：網(wǎng)狀纖維呈黑色、細(xì)胞核呈紅色。

3.脂肪的染色方法：脂肪染色常用脂溶性色素，如蘇丹Ⅲ、蘇丹Ⅳ、油紅O等。這類染料既能溶于有機溶劑如乙醇、丙酮內(nèi)，又能溶于脂肪內(nèi)。由于該類染料在脂質(zhì)中溶解度較大，染色時染料便從染液中轉(zhuǎn)移到被染的脂質(zhì)中去，使脂質(zhì)呈染液的顏色。主要用于顯示組織臟器的脂肪變性和類脂質(zhì)的異常沉著。

蘇丹Ⅲ(Ⅳ)染色方法：

(1) 冰凍切片用70%乙醇漂洗，不超過30s。

(2) 切片入蘇丹Ⅲ(Ⅳ)染液中3~15min或延長至1h。

(3)新50%~70%乙醇分化，直至洗去切片上的浮色為止，蒸餾水洗。

(3) 用稀釋1倍的明礬蘇木精淺染核1min或稍長。

(4) 用濾紙將切片及周圍的水分吸干。

(5) 用甘油或甘油明膠封固。

結(jié)果判定：脂肪呈桔黃色或桔紅色，細(xì)胞核淺藍色。

(二)免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)：是指應(yīng)用免疫學(xué)和傳統(tǒng)的組織化學(xué)的原理，利用抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)對組織、細(xì)胞中的特定抗原(或抗體)進行定位和定性的一種染色技術(shù)。具有較高的敏感性和特異性，其特點是將形態(tài)學(xué)改變與功能、代謝變化結(jié)合起來，直接在組織切片、細(xì)胞涂片或培養(yǎng)細(xì)胞爬片上定位一些蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)的存在，并可到亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)水平，利用計算機圖像分析系統(tǒng)或激光共聚焦顯微鏡技術(shù)等可對被檢物質(zhì)進行定量分析。標(biāo)記物為熒光、酶、免疫金銀及鐵標(biāo)記技術(shù)等。

IHC可用于各種蛋白質(zhì)或肽類物質(zhì)表達水平的檢測、細(xì)胞屬性的判定、淋巴細(xì)胞的免疫表型分析、細(xì)胞增殖和凋亡的研究、激素受體和耐藥基因蛋白表達檢測，以及細(xì)胞周期和信號傳導(dǎo)的研究等。

染色步驟：

(1)石蠟切片脫蠟至水(放入二甲苯中脫蠟后，梯度乙醇至水化)。

(2)3% H2O2室溫孵育5~10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。

(3)蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min，(如需采用抗原修復(fù)，可在此步后進行)。

(4)5%~10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10min。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的*抗體或即用型*抗體，37℃孵育1h或4℃過夜。

(5)PBS沖洗，5min×3次。

(6)滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗(1%BSA-PBS稀釋)或滴加生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃或室溫孵育10~30min。

(7)PBS沖洗，5min×3次。

(8)滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(PBS稀釋)或辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10~30min。

(9)PBS沖洗，5min×3次。

(10)顯色劑顯色(DAB或AEC)。

(11)自來水充分沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。

結(jié)果判定：在光鏡下，陽性細(xì)胞顯示出棕褐色 (DAB)或鮮紅色(AEC)。

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