一、總結(jié)的成敗因素：

1. 有效裂解細(xì)胞。

2. 恰當(dāng)選擇處理樣本的方式：超聲或酶處理。

3. 選用適當(dāng)適量抗體。

4. 恰當(dāng)設(shè)置對(duì)照。

5. 不要過(guò)分交聯(lián)DNA-蛋白質(zhì)。

6. 交聯(lián)所用的甲醛終濃度約為1%，交聯(lián)時(shí)問(wèn)需要預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。

7 . 注意PCR策略具體來(lái)說(shuō)：恰當(dāng)設(shè)置chip實(shí)驗(yàn)對(duì)照，設(shè)置適當(dāng)?shù)年?yáng)性和陰性對(duì)照是進(jìn)行ChIP結(jié)果分析的重要步驟和Trouble shooting的依據(jù)，因?yàn)榉翘禺愋缘拿庖叱恋黼y以避免。

一般的設(shè)置方法

1 未經(jīng)免疫沉淀的超聲處理后樣本( INPUT)。

2 加特異抗體來(lái)源動(dòng)物的正常血清或無(wú)關(guān)抗體(MOCK)。

3 陽(yáng)性對(duì)照引物的應(yīng)用。

4 選擇不與目的蛋白質(zhì)結(jié)合的基因組區(qū)域作對(duì)照。

如 陽(yáng)性對(duì)照抗體 (Anti-acetyl-Histone H3)

* 陰性對(duì)照抗體 (Normal Rabbit IgG)

* PCR引物 (control primer specific for human GAPDH)

二 、抗體選擇，盡可能選擇試劑公司驗(yàn)證過(guò)的CHIP級(jí)抗體

與目的蛋白比，抗體應(yīng)過(guò)量，預(yù)實(shí)驗(yàn)確定抗體用量，選用高質(zhì)量高滴度抗體。

抗體識(shí)別位點(diǎn)不是DNA-Pro結(jié)合的位點(diǎn)。

三、ChIP耗時(shí)長(zhǎng)，什么時(shí)候能夠停止并且冷凍樣本?

I. 甲醛固定和沖洗以后離心下形成的細(xì)胞球狀聚合體。

II. 細(xì)胞溶液(lysate)。

III. 聲波裂解染色質(zhì)后。

IV. 在逆轉(zhuǎn)交聯(lián)后。

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