一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求：
（1） 熟悉玻璃器皿的洗滌包裝和滅菌前的準(zhǔn)備工作。
（2） 學(xué)習(xí)微生物培養(yǎng)基和無(wú)菌水的制備，了解培養(yǎng)基配方中各成分的作用、制備流程及各環(huán)節(jié)的操作技術(shù)與應(yīng)用。
（3） 學(xué)習(xí)并掌握培養(yǎng)基的高壓蒸氣滅菌原理、操作關(guān)鍵技術(shù)和滅菌技術(shù)。
二、實(shí)驗(yàn)原理
培養(yǎng)基的制備原理
培養(yǎng)基是按照微生物生長(zhǎng)發(fā)育的需要，用不同組分的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)調(diào)制而成的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。人工制備培養(yǎng)基的目的，在于給微生物創(chuàng)造一個(gè)良好的營(yíng)養(yǎng)條件。把一定的培養(yǎng)基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的環(huán)境和場(chǎng)所。自然界中，微生物種類(lèi)繁多，由于微生物具有不同的營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的要求也各不相同，加之實(shí)驗(yàn)和研究上的目的不同，所以培養(yǎng)基在組成原料上也各有差異。但是，不同種類(lèi)和不同組成的培養(yǎng)基中，均應(yīng)含有滿足微生物生長(zhǎng)發(fā)育的水分、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和生長(zhǎng)素以及某些特需的微量元素等。此外，培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的酸堿度(pH值)和一定緩沖能力及一定的氧化還原電位和合適的滲透壓。
根據(jù)制備培養(yǎng)基對(duì)所選用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的來(lái)源，可將培養(yǎng)基分為天然培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基三類(lèi)。按照培養(yǎng)基的形態(tài)可將培養(yǎng)基分為液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。根據(jù)培養(yǎng)基使用目的，可將培養(yǎng)基分為選擇培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基及鑒別培養(yǎng)基等。
培養(yǎng)基的類(lèi)型和種類(lèi)是多種多樣的，必須根據(jù)不同的微生物和不同的目的進(jìn)行選擇配制，本實(shí)驗(yàn)分別配制常用培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌和真菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基和馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等固體培養(yǎng)基。
固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中添加凝固劑制成的，常用的凝固劑有瓊脂、明膠和硅酸鈉，其中以瓊脂zui為常用，其主要成份為多糖類(lèi)物質(zhì)，性質(zhì)較穩(wěn)定，一般微生物不能分解，故用凝固劑而不致引起化學(xué)成份變化。瓊脂在95℃的熱水中才開(kāi)始融化，融化后的瓊脂冷卻到45℃才重新凝固。因此用瓊脂制成的固體培養(yǎng)基在一般微生物的培養(yǎng)溫度范圍內(nèi)(25℃-37℃)不會(huì)融化而保持固體狀態(tài)。
高壓蒸氣滅菌原理
高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過(guò)加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100℃的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。
在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三：一是濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低(表Ⅴ-2)，二是濕熱的穿透力比干熱大(表Ⅴ-3)；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1克水在100℃時(shí)，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)可放出2.26kJ(千焦)的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。
表Ⅴ-2 蛋白質(zhì)含水量與凝固所需溫度的關(guān)系

表Ⅴ-3 干熱與濕熱穿透力及滅菌效果比較

在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時(shí)，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否*極為重要，因?yàn)榭諝馀蛎泬捍笥谒羝呐蛎泬海?，?dāng)水蒸汽中含有空氣時(shí)，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。滅菌鍋內(nèi)留有不同分量空氣時(shí)，壓力與溫度的關(guān)系見(jiàn)表Ⅴ-4。一般培養(yǎng)基用1.05kg/cm²，121.3℃ 15-30分鐘可達(dá)到*滅菌的目的。滅菌的溫度及維持的時(shí)間隨滅菌物品的性質(zhì)和容量等具體情況而有所改變。例如含糖培養(yǎng)基用0.56kg/cm²(8磅/英寸²)，112.6℃滅菌15分鐘，但為了保證效果，可將其他成分先行121.3℃，20分鐘滅菌，然后以無(wú)菌操作手續(xù)加入滅菌的糖溶液。又如盛于試管內(nèi)的培養(yǎng)基以1.05kg/cm²，121.3℃滅菌20分鐘即可，而盛于大瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基以1.05kg/cm²滅菌30分鐘。

表Ⅴ-4滅菌鍋內(nèi)留有不同分量空氣時(shí)，壓力與溫度的關(guān)系

蒸汽壓力所用單位為kg/cm²(千克/厘米²)，它與1b/in²(磅/英寸²)和溫度的換算關(guān)系見(jiàn)表Ⅴ-5。

表Ⅴ-5 蒸汽壓力與蒸汽溫度換算關(guān)系

三、實(shí)驗(yàn)器材

1、 藥品 瓊脂，10％HCL,10% NaOH，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方藥品；

2、 材料 具刻度1000毫升塘瓷盅或小鋁鍋，電子稱，10×200mm試管，量筒，小燒杯，玻璃棒，骨匙，pH試紙，分裝漏斗，試管盒，紗布，棉花，報(bào)紙，麻繩，標(biāo)簽，培養(yǎng)皿。

3、 設(shè)備 高壓蒸汽滅菌鍋、烘箱、冰箱、電爐等

四、實(shí)驗(yàn)步驟

1、 稱取藥品放在大燒杯中，加入蒸餾水用玻璃棒攪拌并加熱溶化，等藥品溶解后用pH試紙調(diào)節(jié)p H至7.4-7.6，如有沉淀應(yīng)過(guò)濾后分裝，每支試管約加入9ml。每組分裝30支，加上棉塞，包上牛皮紙，準(zhǔn)備滅菌。

裝入試管中的量不宜超過(guò)試管高度的1/5，裝入三角燒瓶中的量以燒瓶總體積的一半為限。在分裝過(guò)程中，應(yīng)注意勿使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口、以免弄濕棉塞，造成污染。

2、無(wú)菌水準(zhǔn)備

在試管或瓶?jī)?nèi)先盛以適量的蒸餾水〔或理鹽水O．85％NaCl)，蓋好棉塞，包上牛皮紙使其滅菌后，其水量恰為9ml。 每組準(zhǔn)備10支與牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可放在同一試管架上，以一大張牛皮紙包扎寫(xiě)上姓名。準(zhǔn)備滅菌。

3、高壓滅菌

手提式高壓蒸汽滅菌鍋的使用操作步驟：

（1）首先將內(nèi)層滅菌桶取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。

（2）放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。

（3）加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層滅菌桶的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對(duì)稱的方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。

（4）用電爐或煤氣加熱，并同時(shí)打開(kāi)排氣閥，使水沸騰以排除渦內(nèi)的冷空氣。待冷空氣*排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時(shí)，控制熱源，維持壓力至所需時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)用1.05kg/cm²，121.3℃，20分鐘滅菌。

（5）滅菌所需時(shí)間到后，切斷電源或關(guān)閉煤氣，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至0時(shí)，打開(kāi)排氣閥，旋松螺栓，打開(kāi)蓋子，取出滅菌物品。如果壓力未降到0時(shí)，打開(kāi)排氣閥，就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。

（6）將取出的滅菌培養(yǎng)基放入37℃溫箱培養(yǎng)24小時(shí)，經(jīng)檢查若無(wú)雜菌生長(zhǎng)，即可待用。

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