ELISA實(shí)驗(yàn)前的注意事項(xiàng)

為了幫助您更好地解決在實(shí)驗(yàn)中可能碰到的各種問題，我們?cè)O(shè)計(jì)了這些問題指導(dǎo)，配以試劑 盒內(nèi)的說明書一起供您參考使用。如果您在實(shí)驗(yàn)中遇到任何暫時(shí)無法解決的特殊問題，敬請(qǐng)咨詢 ，我們將熱情為您服務(wù)。很多因素都將導(dǎo)致免疫測(cè)定實(shí)驗(yàn)的失敗，而大多數(shù)技術(shù) 失誤是可以通過全面閱讀和準(zhǔn)確理解說明書以及實(shí)驗(yàn)步驟來避免的。若對(duì)試劑盒內(nèi)的說明書有任 何意見和建議，歡迎反饋。我們期待聽到您的聲音，從而完善我們的產(chǎn)品，更好地為您服務(wù)。

◆ 仔細(xì)閱讀說明書

◆ 檢查試劑盒標(biāo)簽上的有效期。如果超過有效期，請(qǐng)勿使用。

◆ 按說明書確定所有試劑齊全（數(shù)量、體積）

◆ 標(biāo)本制備要規(guī)范，每份標(biāo)本體積要按2-3個(gè)復(fù)孔以上的量制備（貯存），盡量分裝做備份。 短期內(nèi)無法實(shí)驗(yàn)者，注意低溫保存

◆ 準(zhǔn)備好所有實(shí)驗(yàn)額外所需物品，（比如移液器，試管，清洗器，酶標(biāo)儀）

◆ 按說明書將所用試劑平衡至室溫，根據(jù)檢測(cè)標(biāo)本數(shù)量確定所需試劑的量

◆ 檢查試劑盒內(nèi)每種試劑的貯存條件，保證所有試劑均按照試劑盒內(nèi)說明書推薦的條件存儲(chǔ)。

◆ 檢查不穩(wěn)定或者變質(zhì)的試劑溶液（比如沉淀或變色）。有些試劑，比如標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液或者檢 測(cè)稀釋液，可能在設(shè)計(jì)時(shí)就含有沉淀物。所有試劑在滴入酶標(biāo)板之前，必需充分混勻。而由 于沉淀物的特性，在加入酶標(biāo)板之前，必需不停攪拌。

◆ 保證充分的孵育時(shí)間和溫度。

 ◆ 切勿使用不同生產(chǎn)批號(hào)的試劑取代現(xiàn)有試劑或混合現(xiàn)有試劑。

◆ 在混合或溶解蛋白溶液時(shí)，避免泡沫產(chǎn)生。

◆ 在實(shí)驗(yàn)開始之前，安排好實(shí)驗(yàn)流程。

◆ 在實(shí)驗(yàn)開始之前，清潔工作臺(tái)。

◆ 若有問題，應(yīng)與我公司或代理商的

洗板方法（Washing Techniques）

任何一個(gè)成功的ELISA檢測(cè)，正確的洗板方法是非常關(guān)鍵和重要的一方面。連貫的洗板也是 很有必要的。在稀釋濃縮洗滌液時(shí)，請(qǐng)使用去離子水或者蒸餾水。

◆ 洗滌瓶或多通道移液器

保證洗瓶內(nèi)壓強(qiáng)良好或者移液器的管頭被適當(dāng)調(diào)整并且無碎屑。檢查板內(nèi)的板條是否安放完 好。將板條編號(hào)以防在傾泄的時(shí)候松動(dòng)便于調(diào)整。首先，傾泄酶標(biāo)板以清空內(nèi)容物。根據(jù)試 劑盒內(nèi)推薦的體積向每孔內(nèi)滴加洗液。若實(shí)驗(yàn)步驟中要求浸泡，則定時(shí)將每孔浸泡*。將 板內(nèi)液體傾倒*，用干凈紙巾擦拭。按照說明書所示重復(fù)以上步驟。zui后一次洗板之后， 將板內(nèi)液體傾倒*，用干凈紙巾拍打表面并擦干。切勿讓孔內(nèi)干燥。按照試劑盒內(nèi)說明書 迅速進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作。

◆ 自動(dòng)洗板儀

將自動(dòng)洗板儀接入適當(dāng)真空（根據(jù)制造商的說明）。確保每管都被適當(dāng)抽吸。首先，通過抽 吸或者傾倒將板清空。根據(jù)試劑盒內(nèi)推薦的體積向每孔內(nèi)滴加洗液。若實(shí)驗(yàn)步驟中要求浸泡， 則定時(shí)將每孔浸泡*。*抽吸各孔，保證沒有洗液殘留。在孔內(nèi)液體被*抽走之后不 要再將裝置至于孔內(nèi)過分抽吸。按照說明書所示重復(fù)以上步驟。zui后一次洗板之后，將板內(nèi) 液體傾倒*，用干凈紙巾拍打表面并擦干。切勿讓孔內(nèi)干燥。按照試劑盒內(nèi)說明書迅速進(jìn) 行下一步實(shí)驗(yàn)操作。 

移液注意事項(xiàng)

◆ 反復(fù)而準(zhǔn)確移液的關(guān)鍵是連貫的操作。流暢而迅速的移液操作是非常重要的。吸液和釋放液 體是都要避免劇烈的移動(dòng)。

◆ 檢查槍頭大小是否合適，是否固定完好。

◆ 在滴加樣品或試劑時(shí)，每次更換槍頭。

◆ 請(qǐng)勿轉(zhuǎn)移小于移液器生產(chǎn)廠家推薦的zui小體積的液體。否則將會(huì)降低實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù) 性。

◆ 某些液體易于附著在槍頭的內(nèi)外表面上，所以，預(yù)先洗滌槍頭以避免由于這種表面張力 而引起的液體體積變化。這樣會(huì)增加移液的準(zhǔn)確性。

◆ 若果需要移動(dòng)的液體是粘稠的，在吸取液體時(shí)，請(qǐng)?jiān)诖∫后w中停留一段時(shí)間，待體積達(dá)到 平衡后再移出。

◆ 用移液器吸取液體之后，用不含棉的絨紙片擦干槍頭的外表面。

◆ 在吸取液體時(shí)槍頭內(nèi)如果出現(xiàn)氣泡，排出已吸液體并重新從容器中緩慢吸取一次。如果槍頭 內(nèi)依然出現(xiàn)氣泡，則更換槍頭。

◆ 在吸取液體時(shí)槍頭內(nèi)如果出現(xiàn)泡沫，則輕微傾斜移液器，并緩慢吸取液體。

◆ 每種試劑均分開配制貯存

樣本信息（Sample Information ）

我能否在實(shí)驗(yàn)開始前一天收集樣品？

◆ 除非試劑盒內(nèi)說明書特別說明不允許，一般都可以。

如果收集的樣品不能夠及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)， 請(qǐng)保存至-20℃或者按照說明書進(jìn)行保存。應(yīng)避免反復(fù)凍融。

◆ -20℃是推薦的冷藏保存溫度。解凍的平衡過程可能會(huì)導(dǎo)致樣品的降解。

我是否必需按照試劑盒內(nèi)說明書中的方法準(zhǔn)備樣品？

◆ 推薦的樣品準(zhǔn)備方法是經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的好的方法，所以推薦按照說明書上的方法制備樣 品。

我能否不用推薦的收集方法來收集血漿？

◆ 每一次按照推薦步驟操作的測(cè)定都是經(jīng)過驗(yàn)證可行的。在某些測(cè)定中有些抗凝劑是不被推薦 的。具體請(qǐng)參看說明書。

 ◆ 有些待檢測(cè)的分析物也存在于血小板中，因此，推薦使用低血小板血漿。正確的收集操作方 法請(qǐng)參看說明書。

我能否使用自己的稀釋液或者緩沖液？

◆ 每個(gè)試劑盒中都含有按配方配制的與特異性樣品種屬相配套的稀釋液，以確保待檢測(cè)的樣品 被正確稀釋。具體請(qǐng)參看說明書。

建議

◆ 確定待檢測(cè)的樣品在收集和制備時(shí)保證無菌操作。

◆ 如果要檢測(cè)多個(gè)樣品，將樣品隔離并標(biāo)記清楚以防相互污染。

◆ 檢測(cè)前，將樣品離心除去顆粒。將樣品轉(zhuǎn)移至新的離心管內(nèi)，混合均勻。

◆ 在混合樣品時(shí)，使用容積至少比樣品體積大50%的離心管以保證混合充分。

 我沒有足量的稀釋液去稀釋所有的樣品，怎么辦？

◆ 試劑盒內(nèi)提供說明書中所的足量的稀釋液。能保證所有的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品檢測(cè)兩次。

◆ 如果沒有推薦的稀釋度，或者需要大量稀釋，請(qǐng)?jiān)趯?shí)驗(yàn)前計(jì)算出所需的稀釋液總量，然后聯(lián) 系技術(shù)服務(wù)部門獲取額外的稀釋液。

我能否使用試劑盒內(nèi)非推薦的樣品類型？

◆ 試劑盒內(nèi)說明書中所的樣品類型是經(jīng)過驗(yàn)證可行的。其它未推薦的樣品類型是沒有經(jīng)過 任何檢測(cè)的。

我使用對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果都在范圍外，為什么？

◆ 如果使用對(duì)照，其濃度應(yīng)該是在某一特定范圍內(nèi)。如果對(duì)照值在范圍外，則是無效測(cè)定。

◆ 確定對(duì)照具有重復(fù)性。

我是否可以將試劑盒中說明書的樣品數(shù)據(jù)作為參考？

◆ 說明書中的樣品數(shù)據(jù)是從有限的檢測(cè)個(gè)體中得出，只能作為大概的指導(dǎo)。

 我是否可以省略說明書中標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品值？

 ◆ 不可以。樣品值必需由每次檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線決定。

如果是手繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，我怎樣決定樣品濃度？

◆ 要決定每個(gè)樣品的濃度，首先找到Y(jié)軸的光度值或者相對(duì)光單位，然后作水平線至標(biāo)準(zhǔn)曲線。 在交點(diǎn)處，作垂線至X軸，讀取相應(yīng)濃度。

我怎樣補(bǔ)償樣品的稀釋度或者濃縮度？

◆ 如果樣品是稀釋型的，標(biāo)準(zhǔn)曲線所讀取的值必需乘以稀釋度。

◆ 如果樣品是濃縮型的，標(biāo)準(zhǔn)曲線所讀取的值必需除以濃縮比。

我怎樣將樣品值的單位轉(zhuǎn)換成Units？

 ◆ 如果可以使用NIBSC/WHO標(biāo)準(zhǔn)，可使用說明書中介紹的相應(yīng)的轉(zhuǎn)換方程進(jìn)行轉(zhuǎn)換。插入你的樣品值到方程中將pg/mL 或者ng/mL轉(zhuǎn)換成Units。

我檢測(cè)到的樣品值在測(cè)定實(shí)驗(yàn)的動(dòng)態(tài)范圍之外，我是否可以用這些數(shù)值？

◆ 只有隨標(biāo)準(zhǔn)曲線降低的樣品值才被推薦使用。在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍外的值都是非線性的，會(huì)導(dǎo)致 錯(cuò)誤的外推值。

◆ 如果測(cè)定的樣品值比zui高的標(biāo)準(zhǔn)品的值還要高，則此樣品需要進(jìn)一步的稀釋并重新進(jìn)行檢 測(cè)。

◆ 如果測(cè)定的樣品值遠(yuǎn)低于測(cè)定范圍，則樣品被認(rèn)為是無法被檢測(cè)。

我的標(biāo)準(zhǔn)曲線看上去還不錯(cuò)，但是卻沒有達(dá)到我預(yù)期的結(jié)果，為什么？

◆ 樣品可能不含有待分析物。

◆ 稀釋液的影響可能遮蔽了檢測(cè)。確保采用說明書推薦的稀釋度。

◆ 如果確實(shí)采用的是推薦的稀釋度，則檢查稀釋操作是否正確。過度稀釋將導(dǎo)致樣品值低于標(biāo) 準(zhǔn)曲線范圍。

度/重復(fù)性（Precision/Reproducibility）

免疫測(cè)定的性可由酶標(biāo)板孔之間的重復(fù)性和每次檢測(cè)之間的重復(fù)性決定。由高CV值引起的 低度一般由兩個(gè)因素引起：移液操作和洗液操作。

我需要在孔內(nèi)混合試劑嗎？

◆ 當(dāng)多種試劑滴加至一個(gè)孔內(nèi)時(shí)（比如稀釋液和樣品），需要在孔內(nèi)進(jìn)行混合。滴加試劑和樣 品至每孔的中心，輕拍酶標(biāo)板使其充分混合。

我的試劑/樣品是粘稠狀的，不易于吸取移動(dòng)，怎么辦？

◆ 在吸取粘稠液體時(shí)，請(qǐng)?jiān)诖∫后w中停留一段時(shí)間，待體積達(dá)到平衡后再移出。

◆ 用相應(yīng)試劑預(yù)洗滌槍頭以補(bǔ)償液體的表面張力。 微量移液器

◆ 槍頭中的液體體積不足或者不均勻，表明移液器需要被校準(zhǔn)。檢查移液器的功能，必要時(shí)重 新校準(zhǔn)。

◆ 在滴加試劑，標(biāo)準(zhǔn)品，樣品時(shí)應(yīng)及時(shí)更換槍頭以避免互相污染。

◆ 檢查槍頭是否安裝完好。如果安裝不得當(dāng)，可能會(huì)導(dǎo)致吸液和排出液體是體積不準(zhǔn)確。

◆ 從容器中移出槍頭時(shí)，將槍頭輕靠在受液容器壁上移去殘留在槍頭外表面的液體。

正確洗板方法

◆ 如果使用自動(dòng)洗板儀，抽吸裝置或者多道移液器。確保每管都被適當(dāng)抽吸。在孔內(nèi)液體被完 全抽走之后不要再將裝置至于孔內(nèi)過分抽吸。按照說明書所示重復(fù)以上步驟。zui后一次洗板 之后，將板內(nèi)液體傾倒*，用干凈紙巾拍打表面并擦干。

◆ 洗板太快或者太慢，不*洗板或者抽吸。

◆ 孔內(nèi)干燥等各種因素都將影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。按照試劑盒內(nèi)說明書迅速進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn) 操作。

我是否可以使用同一容器盛放所有的試劑？

◆ 不可以。請(qǐng)使用不同的容器盛放不同的試劑以避免污染。

◆ 有些待分析物對(duì)污染極其敏感（比如唾液，氧化試劑等等）。根據(jù)說明書，注意預(yù)防試劑盒 內(nèi)試劑污染。

我可以重復(fù)使用蓋板嗎？

◆ 再利用的蓋板上可能含有上一步驟的殘留物，可能會(huì)污染孔內(nèi)現(xiàn)有的成分從而導(dǎo)致性降 低。所以在每次孵育的時(shí)候使用新的蓋板。很多因素都能影響標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果，其中就包括 制備和操作。 標(biāo)準(zhǔn)曲線（Standard Curve） 很多因素都能影響標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果，其中就包括配制和操作。

我是否可以改變標(biāo)準(zhǔn)品的配制？

◆ 不可以。用的稀釋液適當(dāng)稀釋的重組標(biāo)準(zhǔn)品如說明書中所示。

◆ 混合和溶解標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，應(yīng)避免起泡。

◆ 溶解后的標(biāo)準(zhǔn)品靜置至少15分鐘（根據(jù)說明書）。在使用之前輕輕混勻，保證所有的 固體已經(jīng)溶解。

◆ 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，確保所有的稀釋步驟已經(jīng)準(zhǔn)確完成。稀釋時(shí)注意及時(shí)更換槍頭。在移液之前將稀釋液充分混合。

洗滌方式怎樣影響我的標(biāo)準(zhǔn)曲線？

◆ 不*的洗滌會(huì)降低測(cè)定性，導(dǎo)致不理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果。確保洗板機(jī)的正常工作，確 保酶標(biāo)板各孔被充分洗滌卻不干燥。

移液方式怎樣影響我的標(biāo)準(zhǔn)曲線？

◆ 不合理的移液操作會(huì)導(dǎo)致高CV值和不理想曲線。

◆ 在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的過程中，不正確的移液方式會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的稀釋，從而使錯(cuò)誤的數(shù)值進(jìn)入標(biāo) 準(zhǔn)曲線中，或者產(chǎn)生非線性曲線。確保移液器正常工作。每孔中的液體體積不等可能就是移 液器失靈或者槍頭使用不當(dāng)所致。

我的電腦軟件不支持推薦的數(shù)據(jù)歸納方式，我是否可以用其它的？

◆ 可以，然而，每次測(cè)定使用說明書中推薦的數(shù)據(jù)歸納方式。使用不同的數(shù)據(jù)歸納方式會(huì) 導(dǎo)致結(jié)果的浮動(dòng)。

◆ 對(duì)于不同的計(jì)算機(jī)軟件，將標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度設(shè)定為Y軸，濃度設(shè)定為X軸。用對(duì)數(shù)紙作出的 數(shù)據(jù)應(yīng)該是線性的，回歸分析被應(yīng)用于對(duì)數(shù)變換。如果不能使用對(duì)數(shù)紙，則將濃度的對(duì)數(shù)和 OD值的對(duì)數(shù)進(jìn)行線性作圖。zui適曲線由回歸分析決定。

測(cè)定多個(gè)酶標(biāo)板時(shí)是否可以使用同一條標(biāo)準(zhǔn)曲線？

◆ 在測(cè)定不同板中的樣品時(shí)，每一個(gè)板都對(duì)應(yīng)一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。技術(shù)錯(cuò)誤或者不同的孵育情況， 環(huán)境條件都會(huì)引起酶標(biāo)板之間產(chǎn)生不同結(jié)果。一條標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的樣品值必需是在相同環(huán)境 下產(chǎn)生的，否則就是無效值。

我的標(biāo)準(zhǔn)曲線是平的或者是非線性的，這可能是由于什么原因引起的？

引起不理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線的原因有很多，zui常見的原因例舉如下：

◆ 確定稀釋是否得當(dāng)。

◆ 確定波長是否正確。

◆ 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品必需在15-20分鐘內(nèi)滴加入板內(nèi)。（除非試劑盒內(nèi)說明書特別說明）

◆ 檢查背景是否過高。

◆ 確定酶標(biāo)板是否正確洗滌。不恰當(dāng)?shù)南礈炜赡軙?huì)引起具有高背景的平直曲線。

◆ 在測(cè)定過程中重復(fù)讀板。在超過建議時(shí)間后讀板會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。

◆ 如果zui高的標(biāo)準(zhǔn)品的讀數(shù)超過了酶標(biāo)儀的范圍，確定標(biāo)準(zhǔn)品是否正確溶解，孵育時(shí)間和溫度 是否準(zhǔn)確。

◆ 為保證實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性請(qǐng)重復(fù)測(cè)定。

◆ 如果使用對(duì)照，對(duì)照的濃度必須在測(cè)定范圍內(nèi)。

◆ 在檢測(cè)和孵育過程中確定試劑沒有被污染。

◆ 沒有任何信號(hào)的平直標(biāo)準(zhǔn)曲線可能是由于酶結(jié)合物或者底物沒有反應(yīng)。檢查各個(gè)操作過程

◆ 由于許多酶標(biāo)儀的限制，因此建議標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)由高向低做復(fù)孔。

邊緣效應(yīng)（Edge Effect）

邊緣效應(yīng)的定義是酶標(biāo)板孔內(nèi)中心部分與酶標(biāo)板孔內(nèi)遠(yuǎn)離中心部分之間相比存在明顯的信號(hào)差 異，一般歸因于兩個(gè)主要因素。

孵育環(huán)境確實(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)有影響嗎？

◆ 是的。孵育時(shí)溫度不均會(huì)引起邊緣效應(yīng)。請(qǐng)嚴(yán)格按照推薦的溫度進(jìn)行孵育。如果條件允許， 可以在能夠控溫的孵育器中進(jìn)行孵育。

◆ 在使用之前將所有試劑平衡至室溫。（除非特別說明）

◆ 在實(shí)驗(yàn)開始之前檢查工作的環(huán)境溫度。如果曲線很平直，可能是由于工作環(huán)境溫度低于氣溫所致。

在孵育末期我注意到蓋板一側(cè)突起來了，這是否會(huì)影響我的實(shí)驗(yàn)結(jié)果？

◆ 蓋板如果使用不恰當(dāng)會(huì)導(dǎo)致邊緣效應(yīng)。

跳孔（Drift）

跳孔的定義是酶標(biāo)板從左側(cè)到右側(cè)的孔或從上到下的孔內(nèi)信號(hào)出現(xiàn)顯著的倒置現(xiàn)象

我剛配置試劑的時(shí)候中斷了，這是否會(huì)影響我的實(shí)驗(yàn)結(jié)果？

◆ 這可能會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生波動(dòng)的曲線。在移液之前確定所有的標(biāo)準(zhǔn)品或者樣品是否配制完好。請(qǐng)?jiān)?試劑配制完的15-20分鐘內(nèi)滴加入板內(nèi)。（除非特別說明）

我是否需要一個(gè)多道移液器？

◆ 在配制諸如底物，酶結(jié)合物，或者稀釋液的時(shí)候，選擇連續(xù)或多道移液器。

如果我沒有平衡試劑會(huì)怎樣？

◆ 沒有平衡的試劑會(huì)導(dǎo)致孔之間溫度不均，使整個(gè)酶標(biāo)板的信號(hào)產(chǎn)生變異。除非特別說明，試 劑一般在使用之前都要平衡至室溫。

◆ 每次檢測(cè)都會(huì)有推薦的孵育時(shí)間和溫度。冷凍的試劑一般需要更長的孵育時(shí)間。所以使 用說明書上推薦的孵育溫度和時(shí)間。

我是否需要蓋板？

◆ 參看試劑盒內(nèi)說明書。如果說明書內(nèi)的實(shí)驗(yàn)步驟中有推薦使用蓋板，則在使用時(shí)應(yīng)選用與酶 標(biāo)板配套的蓋板，使邊緣與酶標(biāo)板緊密契合。如果蓋板的一邊突起，則會(huì)產(chǎn)生信號(hào)的差別。

酶標(biāo)儀的設(shè)置怎樣影響我的結(jié)果？

◆ 對(duì)于底物測(cè)定，如果讀數(shù)時(shí)間等于或超過2秒/孔，使從*孔到zui后一孔在讀書時(shí)存在時(shí)間 上的延誤，會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的異變。在底物反應(yīng)階段，辣根過氧化物酶會(huì)一直作用直到底物反應(yīng) *。而由于時(shí)間的延誤，底物越來越少，底物反應(yīng)也受到影響。將酶標(biāo)儀的讀數(shù)時(shí)間設(shè)定 為1.0秒/孔。

我是否可以根據(jù)自己的方案來調(diào)整孵育時(shí)間？

◆ 更改孵育時(shí)間或溫度會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)不能達(dá)到平衡或過度反應(yīng)。請(qǐng)按照說明書推薦的孵育時(shí)間和 溫度操作。

◆ 如果同時(shí)進(jìn)行多項(xiàng)檢測(cè)，對(duì)每孔必需分別計(jì)時(shí)已避免孵育不足或過度孵育。 信號(hào)變化（Signal Development） 信號(hào)的變化受以下幾個(gè)因素影響：底物，孵育時(shí)間，酶結(jié)合物和底物反應(yīng)失敗，波長和儀器。

我是否可以更改底物處理的方法？

◆ 如果反應(yīng)物溶液需要混合，確保加入的反應(yīng)物試劑體積正確并充分混合?；旌虾蟮娜芤罕匦?在15分鐘內(nèi)使用（化學(xué)發(fā)光檢測(cè)zui多4小時(shí)）。如果反應(yīng)物混合得太早，則在容器中的顏色 可能會(huì)發(fā)生變化。

◆ 如果底物是凍干品或片劑，則根據(jù)說明書中的方法用適當(dāng)體積的稀釋液將其*溶解?；旌?*后并在說明書中推薦的時(shí)間內(nèi)使用。

我在移液的時(shí)候是否要按照一定的順序？

◆ 根據(jù)說明書中的順序進(jìn)行移液操作。

◆ 高靈敏度檢測(cè)利用了放大系統(tǒng)。在底物孵育完成之后，按照加底物的順序依次加入放大試劑。

◆ 底物加完之后，輕拍酶標(biāo)板使其充分混合。

底物有可能被污染嗎？

◆ 是的。如果測(cè)定時(shí)使用的是堿性磷酸酶或者辣根過氧化物酶標(biāo)記的結(jié)合物，在測(cè)定時(shí)要注意 避免污染。污染可能會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生超過酶標(biāo)儀范圍的值。避免與金屬或氧化試劑接觸。使用新容器。

底物是否需要在黑暗環(huán)境中進(jìn)行孵育？

◆ 不需要。不過在孵育過程中應(yīng)避免陽光直射。

溫度怎樣影響結(jié)果？

◆ 堿性磷酸酶或者辣根過氧化物酶都是光敏感型酶。光密度單位或者相對(duì)光單位都會(huì)隨著溫度 的改變而變化。

◆ 避免在環(huán)境條件變化劇烈的地方孵育。（比如通風(fēng)口，窗口這些溫度和光照都劇烈變化的地 方） 為了保證酶結(jié)合物和底物反應(yīng)*：

◆ 對(duì)于比色法測(cè)定： 將同體積的結(jié)合物和底物溶液充分混合（對(duì)于高靈敏度的試劑盒，在加入同體積的結(jié)合物和 底物一分鐘之后，再加入等體積的擴(kuò)增劑）。顏色若不是立即顯現(xiàn)，則檢查所加成分是否在 正確的貯藏溫度下保存，是否被污染，是否在有效期內(nèi)。

我是否需要校正波長？

◆ 對(duì)于比色法測(cè)定，需要通過校正波長來減少誤差。

如果我沒有校正波長應(yīng)該怎么辦？

◆ 將所讀波長減去原始校正波長。這個(gè)方法可以更正光學(xué)誤差。

我的酶標(biāo)儀上沒有說明上推薦的那種用來校正波長的濾光片，我可以用別的嗎？

◆ 可以。只要選擇的波長高于推薦的校正波長即可。

我的酶標(biāo)儀沒有說明書上推薦的波長，我可以用別的嗎？

◆ 推薦波長由使用的底物和反應(yīng)后顏色的峰吸收度決定。說明書上一般都有相應(yīng)數(shù)據(jù)，如果沒有，則選擇zui接近的波長。不過，這種數(shù)據(jù)變化比較大。

為什么我的相對(duì)光單位與說明書上的不一致？

◆ 由于工業(yè)上對(duì)于光單位的衡量沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，所以相對(duì)光單位在酶標(biāo)儀之間的變化非常 大。相對(duì)光單位的數(shù)值應(yīng)該具有可比性。

◆ 使用推薦的酶標(biāo)儀設(shè)置，如果使用不同的酶標(biāo)儀則進(jìn)行相應(yīng)的等值設(shè)置。不同的設(shè)置會(huì)產(chǎn)生 不同的信號(hào)。

◆ 在讀數(shù)窗口準(zhǔn)確讀數(shù)。

我是按照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行測(cè)定的，但是沒有任何信號(hào)，為什么？

◆ 對(duì)于使用HRP底物的比色測(cè)定，終止液的加入會(huì)使底物變色。而說明書推薦的波長就是zui 適波長。

◆ 通過輕拍酶標(biāo)板的邊緣充分混合孔內(nèi)試劑。加入終止液的時(shí)，顏色由藍(lán)變黃（如果是HRP 底物）。如果加終止液之前孔內(nèi)試劑沒有混合，則底物顏色變綠。

◆ 可能加入試劑的順序錯(cuò)誤。

◆ 加入底物溶液以后不要清洗酶標(biāo)板。

◆ 在連續(xù)稀釋時(shí)確定已經(jīng)加入標(biāo)準(zhǔn)品。

◆ 如果底物系統(tǒng)中有兩個(gè)成分，則必需混合均勻。

◆ 確定酶標(biāo)儀的使用和操作正確。

◆ 確定試劑，標(biāo)準(zhǔn)品，樣品都正確配制并按照說明滴加無誤。

◆ 對(duì)于高敏感性試劑盒，確定使用的底物和放大劑都正確稀釋。

引起高背景的原因有哪些？

◆ 孵育時(shí)間和溫度的改變。

◆ 不恰當(dāng)?shù)南礈臁?

◆ 試劑被污染。

◆ 孵育時(shí)酶標(biāo)板被污染。

◆ 蓋板，容器或者槍頭的重復(fù)使用

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