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實(shí)驗(yàn)室常用微生物菌種的分離和純化方法
混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱為微生物分離與純化。在分子生物學(xué)的研究及應(yīng)用中，不僅需要通過(guò)分離純化技術(shù)從混雜的天然微生物群中分離出特定的微生物，而且還必須隨時(shí)注意保持微生物純培養(yǎng)物的“純潔”，防止其他微生物的混入。
1、用固體培養(yǎng)基分離和純化
單個(gè)微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長(zhǎng)、繁殖到一定程度可以形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞生長(zhǎng)群體，稱為菌落。當(dāng)固體培養(yǎng)基表面眾多菌落連成一片時(shí)，便成為菌苔。不同微生物在特定培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成的菌落或菌苔一般都具有穩(wěn)定的特征，可以成為對(duì)該微生物進(jìn)行分類、鑒定的重要依據(jù)。大多數(shù)**、酵母菌、以及許多**和單細(xì)胞藻類能在固體培養(yǎng)基上形成孤立的菌落，采用適宜的平板分離法很容易得到純培養(yǎng)。所謂平板，即培養(yǎng)平板的簡(jiǎn)稱，它是指固體培養(yǎng)基倒入無(wú)菌平皿，冷卻凝固后，盛固體培養(yǎng)基的平皿。這方法包括將單個(gè)微生物分離和固定在固體培養(yǎng)基表面或里面。固體培養(yǎng)基用瓊脂或其它凝膠物質(zhì)固化的培養(yǎng)基，每個(gè)孤立的活微生物體生長(zhǎng)、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。*常用的分離、培養(yǎng)微生物的固體培養(yǎng)基是瓊脂固體培養(yǎng)基平板。這種由Kock建立的采用平板分離微生物純培養(yǎng)的技術(shù)簡(jiǎn)便易行，100多年來(lái)一直是各種菌種分離的*常用手段。
1.1 稀釋倒平板法
首先把微生物懸液作一系列的稀釋（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分別取不同稀釋液少許，與已熔化并冷卻至50℃左 右的瓊脂培養(yǎng)基混合，搖勻后，傾入滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養(yǎng)一定時(shí)間即可出現(xiàn)菌落。如果稀釋得當(dāng)，在平板表面或瓊脂培養(yǎng)基中就可出現(xiàn)分散的單個(gè)菌落，這個(gè)菌落可能就是由一個(gè)**細(xì)胞繁殖形成的。隨后挑取該單個(gè)菌落，或重復(fù)以上操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)。
1.2 涂布平板法
因?yàn)閷⑽⑸飸乙合燃拥捷^燙的培養(yǎng)基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡，且采用稀釋倒平板法也會(huì)使一些嚴(yán)格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長(zhǎng)，因此在微生物學(xué)研究中常用的純種分離方法是涂布平板法。其做法是先將已熔化的培養(yǎng)基倒入無(wú)菌平皿，制成無(wú)菌平板，冷卻凝固后，將一定量的微生物懸液滴加在平板表面，再用無(wú)菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個(gè)平板表面，經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落
2、用液體培養(yǎng)基分離和純化
大多數(shù)**和**，用平板法分離通常是滿意的，因?yàn)樗鼈兊拇蠖鄶?shù)種類在固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)得很好。然而迄今為止并不是所有的微生物都能在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，例如一些細(xì)胞大的**、許多原生動(dòng)物和藻類等，這些微生物仍需要用液體培養(yǎng)基分離來(lái)獲得純培養(yǎng)。
稀釋法是液體培養(yǎng)基分離純化常用的方法。接種物在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行順序稀釋，以得到高度稀釋的效果，使一支試管中分配不到一個(gè)微生物。如果經(jīng)稀釋后的大多數(shù)試管中沒有微生物生長(zhǎng)，那么有微生物生長(zhǎng)的試管得到的培養(yǎng)物可能就是純培養(yǎng)物。如果經(jīng)稀釋后的試管中有微生物生長(zhǎng)的比例提高了，得到純培養(yǎng)物的機(jī)率就會(huì)急劇下降。因此，采用稀釋法進(jìn)行液體分離，必須在同一個(gè)稀釋度的許多平行試管中，大多數(shù)（一般應(yīng)超過(guò)95%）表現(xiàn)為不生長(zhǎng)。
3、單細(xì)胞（孢子）分離
只能分離出混雜微生物群體中占數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)的種類是稀釋法的一個(gè)重要缺點(diǎn)。在自然界，很多微生物在混雜群體中都是少數(shù)。這時(shí)，可以采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)，稱為單細(xì)胞（或單孢子）分離法。單細(xì)胞分離法的難度與細(xì)胞或個(gè)體的大小成反比，較大的微生物如藻類、原生動(dòng)物較容易，個(gè)體很小的**則較難。
較大的微生物，可采用毛細(xì)管提取單個(gè)個(gè)體，并在大量的**培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移清洗幾次，除去較小微生物的污染。這項(xiàng)操作可在低倍顯微鏡，如解剖顯微鏡下進(jìn)行。對(duì)于個(gè)體相對(duì)較小的微生物，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下用毛細(xì)管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個(gè)微生物細(xì)胞或孢子以獲得純培養(yǎng)。在沒有顯微操作儀時(shí)，也可采用一些變通的方法在顯微鏡下進(jìn)行單細(xì)胞分離，例如將經(jīng)適當(dāng)稀釋后的樣品制備成小液滴在顯微鏡下觀察，選取只含一個(gè)細(xì)胞的液體來(lái)進(jìn)行純培養(yǎng)物的分離。單細(xì)胞分離法對(duì)操作技術(shù)有比較高的要求，多限于高度專業(yè)化的科學(xué)研究中采用。