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雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法，但要注意的是在一步法（待測抗原與酶標(biāo)抗體一起加入反應(yīng)）測定中，當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成“夾心復(fù)合物”出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)，甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此在使用一步法試劑測定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應(yīng)注意可測范圍的zui高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。
雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風(fēng)濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結(jié)合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標(biāo)本中如含有RF，它可充當(dāng)抗原成份，同時與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合，表現(xiàn)出假陽性反應(yīng)。
雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。
雙抗體夾心法的簡要操作步驟為：
1）先加入抗體，使抗體固定結(jié)合于載體表面；
2）再加樣品，使目標(biāo)檢測抗原形成抗原-抗體復(fù)合物；
3）加酶標(biāo)抗抗體（第二種動物抗抗原的酶標(biāo)抗體）；
4）加入酶促反應(yīng)底物，發(fā)生顯色反應(yīng)，顯色的深淺與待測抗原的量成正比。
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