培養(yǎng)基傳代細(xì)胞染色體制備步驟

　　1．培養(yǎng)細(xì)胞：取處于指數(shù)生長(zhǎng)期、用較大瓶皿培養(yǎng)的、80％～90％匯合單層培養(yǎng)細(xì)胞。

　　2．加秋水仙素：使用zui終濃度為0.02～0.8微克/毫升營(yíng)養(yǎng)液，溫箱繼續(xù)培養(yǎng)6～10小時(shí)；或用低溫封閉法：把培養(yǎng)基細(xì)胞置于4℃條件下6～12小時(shí)后，再于37℃溫箱繼續(xù)培養(yǎng)6～10小時(shí)處理（加秋水仙素）。

　　3．采集分裂細(xì)胞：可利用分裂中期細(xì)胞體變圓與底物附著不牢特點(diǎn)，此時(shí)手持培養(yǎng)瓶，左右反復(fù)橫向水平搖動(dòng)，令培養(yǎng)液在培養(yǎng)細(xì)胞表面反復(fù)沖刷。應(yīng)用此法可使90％的中期分裂細(xì)胞從瓶壁脫落，注意勿用力過(guò)猛，以防多量非分裂細(xì)胞脫落影響觀察。

　　4．離心：收集培養(yǎng)液，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5～10分鐘。

　　5．培養(yǎng)基低滲處理：吸除上清液、加入預(yù)溫至37℃的0.075M KCl溶液，在溫箱中靜置20～30分鐘。

　　6．預(yù)固定：向懸液中加新鮮1：3醋酸、甲醇固定液1ml，用吸管吹打調(diào)勻，此措施能起到先使細(xì)胞表面輕微固定，可防止固定后細(xì)胞粘連成塊。

　　7．固定：離心，同4，吸除上清液，加新鮮固定劑5～10ml；加固定劑時(shí)要用一手微斜持離心管，另手用吸管吸取固定劑，把固定劑逐滴滴在離心管壁上，使之慢慢流入離心管中，然后輕輕吹打均勻，置15～20分鐘。

　　8．重復(fù)7，末次離心后，小心吸除大部分上清，據(jù)懸液中細(xì)胞密度大小，余下固定液0.5～1ml。

　　9．制片：用滴片法制片，按如下步驟：*洗凈載物片，勿留任何油脂，置冰箱中儲(chǔ)備備用。滴片前現(xiàn)從冰箱中取出冷載物片1片，在載物片表面出現(xiàn)細(xì)微水氣時(shí)，立即向片的一側(cè)滴2～3滴細(xì)胞培養(yǎng)基懸液，滴片時(shí)的距離能保持半米高度才好。滴片后置室溫中令其自然干燥，或用吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)吹干亦可。如此制備好的標(biāo)本可置盒中備用或立即進(jìn)行染色觀察。

　　10．染色和封片：一般常用Giemsa染色：取干液Giemsa 1份加pH6.8磷酸緩沖液9份混合，染色10分鐘后，水洗、晾干、可直接觀察。如標(biāo)本需要保存或做長(zhǎng)時(shí)間觀察，可過(guò)二甲苯兩次后，用中性樹膠封片后，再過(guò)二甲苯，然后封片亦可。