河源市藥物結(jié)構(gòu)確認(rèn)及雜質(zhì)分析-CMA資質(zhì)
NMR(核磁共振)測試
儀 器:德國 Bruker DRX- 400 ,400MHz超導(dǎo)脈沖付里葉變換核磁共振譜儀;
測試條件:溶 劑: CDCl3
參 考 物: TMS
溫 度: 20ºC
頻 率: 1H譜:400.130MHz;13C譜:100.613MHz
測試結(jié)果:樟腦樣品(批號為:Yz1408019)經(jīng)核磁共振氫(1H)譜、碳(13C)譜、DEPT(DEPT135和DEPT90)譜、1H-1H COSY譜、13C-1H COSY譜、HMBC譜分析,確認(rèn)該樣品與樟腦(即1,7,7-*基二環(huán)[2,2,1]庚烷-2-酮)的化學(xué)結(jié)構(gòu)(見結(jié)構(gòu)圖)相符。
5. MRM 技術(shù)在定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用復(fù)雜組分共流出物的干擾和寬達(dá)9 個數(shù)量級以上的動態(tài)范圍,一直是影響血清或血漿等生物體液中蛋白質(zhì)、多肽準(zhǔn)確定量的關(guān)鍵因素。盡管研究者們也嘗試采用多種方法,包括盡可能充分的色譜分離,去除高豐度蛋白質(zhì)等,但質(zhì)譜對低豐度蛋白質(zhì)
的檢測靈敏度和精密度仍不能滿足分析的要求。M R M 技術(shù)在定量蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用上展現(xiàn)了其方法
的優(yōu)點(diǎn)。首先,在一定程度上提高了測定的動態(tài)范圍,其原因一方面是因?yàn)閷﹄x子的選擇檢出,降低了復(fù)雜組分的背景信號,增強(qiáng)了一些低豐度蛋白質(zhì)的檢測靈敏度;另一方面通過對高豐度、低豐度蛋白質(zhì)M R M 離子對的選擇來均衡兩者的響應(yīng)信號差異。例如,對高豐度蛋白質(zhì),選擇響應(yīng)豐度較低的母離子- 子離子對;對低豐度蛋白質(zhì),選擇響應(yīng)程度較高的母離子- 子離子對,從而均衡高、低豐度的信號差異。其次,減少了復(fù)雜組分共流出物的干擾,增強(qiáng)了檢測的特異性。此外,MRM 技術(shù)高通量的特點(diǎn),也為多種蛋白質(zhì)的同時定量提供了條件。M R M 技術(shù)通過與同位素稀釋法或m T R A Q 技術(shù)結(jié)合,對已知量加入的內(nèi)標(biāo)肽段和樣本中的真實(shí)肽段分別進(jìn)行標(biāo)記,選擇不同母- 子離子對獲得不同的色譜檢出信號,比較兩者信號,從而產(chǎn)生定量結(jié)果[12,13]。
Anderson 等[14]用MRM 技術(shù)定量分析了人體血漿中53 種高、中豐度蛋白質(zhì)。其中47 個數(shù)據(jù)同批變異系數(shù)為2%~22%,顯示了定量的良好精密度。分析結(jié)果的動態(tài)范圍達(dá)到4.5 個數(shù)量級。Lin 等[15]用M R M 定量測定了人體血漿中中等豐度蛋白質(zhì)的實(shí)際濃度。測定結(jié)果表明其濃度范圍達(dá)到了3~700 nmol/L。12 次反復(fù)測量變異系數(shù)(CV)值小于25%。對于血漿中的低豐度蛋白質(zhì),Keshishian 等[16]也采用MRM 和同位素稀釋的方法進(jìn)行了定量分析。在未進(jìn)行蛋白質(zhì)或多肽親和富集的條件下,去除血漿6 種高豐度蛋白質(zhì)后,低豐度蛋白質(zhì)的檢測限在1~10 mg/L,CV值在3%~15%,與質(zhì)譜直接檢測血漿蛋白的方法相比,分析性能改善了1000 倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了這種MRM 技術(shù)進(jìn)行定量的高精密度,以及用于分析復(fù)雜樣本的高動態(tài)范圍。
6. MRM 技術(shù)在蛋白質(zhì)與RNA 相互作用研究中的應(yīng)用蛋白質(zhì)- R N A 復(fù)合物在調(diào)控真核細(xì)胞的基因表達(dá)上具有重要意義。基于M S 的方法研究蛋白質(zhì)與R N A 的相互作用多有報道,而采用M R M 與其他技術(shù)相結(jié)合的方法,能更深入地研究蛋白質(zhì)與RNA 作用的結(jié)構(gòu)域,得到更豐富的相互作用結(jié)構(gòu)信息。其原理是:通過母離子掃描的模式,獲得含有磷酸碎片的所有多肽離子的準(zhǔn)確分子量和電荷數(shù)。設(shè)計MRM 離子對,母離子掃描獲得的信號離子作為母離子,子離子設(shè)定為堿基序列AUGC ,在MRM 的檢測域值達(dá)到設(shè)定值后,進(jìn)行高分辨增強(qiáng)子離子掃描, 終獲取蛋白質(zhì)序列信息和與其作用的R N A 序列信息。Lenz 等[17]采用此方法,研究了U1SnRNP 和1515K-61K-U4atacSnRN 與RNA 的相互作用信息,分別用*和R N A 酶T 1、A 對蛋白質(zhì)和R N A 進(jìn)行酶切,得到相互作用的短肽段和RNA 的短序列,在負(fù)離子模式進(jìn)行母離子掃描,依據(jù)獲得的結(jié)果設(shè)計MRM 母- 子離子對,在正離子模式進(jìn)行MRM-子離子增強(qiáng)掃描,后得到了相互作用結(jié)構(gòu)域等更為詳細(xì)的信息。
7. 展望M R M 技術(shù)是基于蛋白質(zhì)或多肽的已知信息或假定信息進(jìn)行質(zhì)譜信號采集,有針對性地獲取數(shù)據(jù)的方式。通過與其他質(zhì)譜掃描技術(shù)的聯(lián)合使用,能在蛋白質(zhì)組研究中充分展現(xiàn)其高靈敏度、高準(zhǔn)確性、高重復(fù)性、高通量的應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)??梢灶A(yù)見,通過對M R M 技術(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化,例如優(yōu)化M R M 母-子離子的選擇條件,從已有的蛋白質(zhì)譜中人工獲取或利用軟件計算母- 子離子;優(yōu)化每次運(yùn)行MRM 離子對的數(shù)目,改善色譜峰形,或者通過設(shè)立不同時間段檢測離子對,增加分析通量;聯(lián)合其他多種質(zhì)譜掃描技術(shù),將使M R M 技術(shù)擁有更好的應(yīng)用前景,更有效地滿足蛋白質(zhì)組學(xué)的分析需求。
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