核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)下載

【資料簡(jiǎn)介】

核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒(Nuclear-Cytosol Extraction Kit ) 
 
描述：本試劑盒用于從哺乳動(dòng)物組織和培養(yǎng)細(xì)胞中提取核蛋白和/或胞質(zhì)蛋白，提取制備過(guò)程簡(jiǎn)便。制備的
核蛋白和胞漿蛋白能保持天然活性，并且純度較高。提取的蛋白特別適于轉(zhuǎn)錄因子活性分析、凝膠阻滯實(shí)
驗(yàn)(gel shift assay, EMSA)、免疫共沉淀、酶活性測(cè)定，也適于 Western Blot 實(shí)驗(yàn)。  
 
核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒(Nuclear-Cytosol Extraction Kit ) 組份 
Kit compositions  50 extractions  100 extractions  Storage 
Cytosol Extraction Buffer A (CEB-A)  25 ml    50 ml  4 
o
C, 1 year 
Cytosol Extraction Buffer B (CEB-B)  1.5 ml  2×1.5 ml  4 
o
C, 1 year 
Nuclear Extraction Buffer (NEB)  5 ml  10 ml  4 
o
C, 1 year 
注意：不含蛋白酶抑制劑成分 
 
實(shí)驗(yàn)的一般考慮 
1.  所有的操作都應(yīng)在冰浴中進(jìn)行，  所有的試劑在實(shí)驗(yàn)前都要預(yù)冷。 
2.  根據(jù)大致的細(xì)胞數(shù)，或者根據(jù)離心后的細(xì)胞體積(Packed cell volume, PCV)，估計(jì)試劑加入的量。PCV
因細(xì)胞類(lèi)型不同而有所差異。細(xì)胞數(shù)、PCV和加入試劑的關(guān)系參見(jiàn)下表： 
培養(yǎng)皿直徑  35 mm or  或 1 孔六孔板  60 mm  10 cm 
培養(yǎng)皿面積  10 cm2
  30 cm2
  75 cm2
 
估計(jì)細(xì)胞數(shù)量  5 ×105
  1 ×106
  5 ×106
 
估計(jì) PCV(μl)  5  10~20  50~100 
加入 CEB-A (μl)  25  50~100  300~500 
加入 CEB-B (μl)  1.2~1.5  3~6  3~6 
加入 NEB (μl)  5~10  20  100 
 
操作步驟 
1.  裂解：(1)  培養(yǎng)細(xì)胞，PBS 洗滌細(xì)胞兩次，估計(jì)大致的細(xì)胞數(shù)，或者估計(jì)離心后的細(xì)胞體積 PCV。每
1 ×106
個(gè)細(xì)胞加入 50~100μl 的 CEB-A，刮下細(xì)胞轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的 1.5ml 離心管；或者每體積 PCV細(xì)胞
加入 5 倍 PCV 體積的 CEB-A (即 10~20 μl PCV的細(xì)胞加 50~100μl 的 CEB-A)，劇烈振蕩重懸。(2) 組
織樣本，稱(chēng)重后剪成小塊，PBS 洗滌兩次。通常每 10 mg 動(dòng)物組織相當(dāng)于 1×106
個(gè)細(xì)胞，需加入
50~100μl CEB-A，可根據(jù)組織重量按比例加入。在冰上用玻璃勻漿器或高速粉碎器破碎組織或細(xì)胞。
使用玻璃勻漿器通常需要 20~40 次上下抽動(dòng)勻漿。 
2.  裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的 1.5ml 離心管，劇烈振蕩 30 秒，冰浴10~15min，期間每 5 分鐘振蕩 15 秒。 
3.  根據(jù)裂解物體積加入 1/20 體積的 CEB-B，振蕩 10 秒，冰浴1min (加入 CEB-B 可去除核膜，適于制備
高純度的核蛋白，但可使胞漿蛋白出現(xiàn)很少量的膜蛋白污染，欲制備高純胞漿蛋白可省略此步驟)。 
4.  1000g 4 o
C 離心 5 分鐘，沉淀即是核粗提物，上清則是粗制的胞漿蛋白組分。 
5.  胞漿組分制備：將上清轉(zhuǎn)入另一預(yù)冷的離心管，12000g 4 o
C 離心，棄沉淀，取上清即得胞質(zhì)蛋白組分，
于−20~−70ºC 保存。 
6.  核粗提物處理：取第步驟 4 的核粗提物沉淀，加入 100μl CEB-A和 5 μl CEB-B 振蕩10 秒洗滌沉淀，
冰浴 1min，1000g 5min 棄上清。再次加入 100μl CEB-A和 5 μl CEB-B 重復(fù)此步驟。 
7.  核蛋白制備：在離心沉淀物（細(xì)胞核）中加入 50~100μl 預(yù)冷的 NEB (可選：使用前每 ml NEB 加入 1μL 
DTT，5μL PMSF，5μl 蛋白酶抑制劑)，劇烈振蕩 15 秒，冰上30min，期間每 10 min 振蕩 15 秒。12000g 
5min，上清液含核蛋白成分，其中含有 25%的甘油；轉(zhuǎn)入新管−20~−70ºC 保存。 
8.  只需對(duì)提取的胞質(zhì)組分進(jìn)行蛋白定量(Braford或 BCA法)，核蛋白純度高但含量低，無(wú)需定量。 
 
核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒(Nuclear-Cytosol Extraction Kit ) 說(shuō)明：按照說(shuō)明書(shū)操作，每 106
個(gè)細(xì)胞可得到 50-75μg 蛋白。試劑盒在不加入蛋白酶抑制劑時(shí)仍然工作良
好，但用戶(hù)可自行加入。裂解時(shí)間是重要的，過(guò)短則細(xì)胞裂解不全導(dǎo)致蛋白產(chǎn)率低，裂解時(shí)間長(zhǎng)則導(dǎo)致胞
漿蛋白有核蛋白污染。上述制備的蛋白樣品與 2x SDS-PAGE 混合即可上樣電泳。 
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