實時定量PCR技術(shù)綜述

【資料簡介】

一．基本原理 
1.pcr反應(yīng)動力學(xué) 
右圖為PCR反應(yīng)曲線（橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)表征產(chǎn)物量），不同的曲線代表初始模板量不同的 PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)的動力學(xué)公式為： 
Cn=C0(1+E)n 
其中C0和Cn分別為初始模板和n循環(huán)的拷貝數(shù)，n為循環(huán)數(shù)，E為擴(kuò)增效率（0≤E≤1），理想狀態(tài)下（即每個循環(huán)中所有模板均與引物結(jié)合并等到擴(kuò)增），E為1。 
實時定量PCR技術(shù)綜述

由上圖可知，只有在線性區(qū)段E值才為定值，這樣才能通過檢測Cn定量C0，由于終點檢測不能保證在線性區(qū)段，所以重復(fù)性不好，實時檢測（每個循環(huán)檢測一次）技術(shù)解決了這個問題。 
2.定量pcr原理 
實時定量PCR技術(shù)綜述定量pcr是將待測標(biāo)本與一系列濃度（C0）已知的標(biāo)準(zhǔn)品在同一條件下共同擴(kuò)增，并進(jìn)行實時檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的檢測值及已知的C0值作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，如右圖（橫作標(biāo)為的C0對數(shù)值），再根據(jù)待測標(biāo)本的檢測值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到待測標(biāo)本的C0值。 
3.信號產(chǎn)生 
目前定量PCR技術(shù)信號產(chǎn)生都是基于FRET (fluorescence resonance energy transfer)的原理，即在一定波長的光激發(fā)下，一個熒光基團(tuán)A發(fā)光，并且被鄰近的另一個熒光基團(tuán)B吸收，使熒光基團(tuán)B發(fā)光。如檢測熒光基團(tuán)A，應(yīng)在FRET消除后；如檢測B，則應(yīng)在FRET發(fā)生時檢測。 
根據(jù)信號產(chǎn)生方式的不同可將定量PCR技術(shù)分為三類：TaqMan Probes技術(shù)；Hybridization Probes技術(shù)；Molecular Beacons技術(shù)。 
TaqMan Probes技術(shù)（右圖A）是Perkin 實時定量PCR技術(shù)綜述Elmer公司1995年研制，利用熱穩(wěn)定DNA聚合酶5’→3’外切酶活性，將TaqMan 探針5’端熒光基團(tuán)切去，使之與3’端熒光基團(tuán)分離、熒光淬滅消失，在特定波長下檢測5’端熒光基團(tuán)即可表征PCR產(chǎn)物的量。
Hybridization Probes技術(shù)（右圖B）是Roche公司建立的，PCR反應(yīng)退火過程中，兩個探針與模板雜交（相鄰一個堿基），發(fā)生FRET，這時檢測第二個熒光基團(tuán)即可表征PCR產(chǎn)物的量。Hybridization Probes技術(shù)要求熱穩(wěn)定DNA聚合酶不具備5’→3’外切酶活性，而是在引物延伸過程中被取代，使探針可在下一循環(huán)再與模板雜交，如探針被降解，可導(dǎo)致定量不準(zhǔn)。

Molecular Beacons技術(shù)（上圖C）利用莖環(huán)結(jié)構(gòu)的探針，當(dāng)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)時，發(fā)生熒光淬滅，退火過程中，探針與模板雜交，熒光淬滅消失，在特定波長下檢測5’端熒光基團(tuán)即可表征PCR產(chǎn)物的量。