輔酶 NAD（H） Ⅰ 含量試劑盒

【資料簡(jiǎn)介】

輔酶 NAD(H) Ⅰ 含量試劑盒說明書 分光光度法 50 管/24 樣 
測(cè)定意義 
輔酶 NAD(H) Ⅰ 廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，NAD+
是糖酵解（EMP）和
三羧酸循環(huán)（TCA）的主要?dú)涫荏w，生成的 NADH 經(jīng)呼吸電子鏈（ETC）傳遞把電子交給
氧，在合成 ATP的同時(shí)，形成大量的 ROS，同時(shí) NADH 再生為NAD+
。糖、脂、蛋白質(zhì)三
大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD+
比
值的高低可用于評(píng)價(jià)糖酵解和 TCA 循環(huán)的強(qiáng)弱。較高的 NAD(H)及 NADH/NAD+
比值說明
細(xì)胞呼吸耗氧量較高，處于過氧化狀態(tài)。此外，NADH/NAD+
比值升高也可抑制糖酵解和
TCA循環(huán)。另外，NAD+
降解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、 代謝和基因表達(dá)等具有重要的調(diào)控作用。  
輔酶 NAD(H) Ⅰ 含量試劑盒測(cè)定原理 
分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NAD+
和 NADH，NADH通過 PMS的遞氫作用，還原
氧化型噻唑藍(lán)（MTT）為甲瓚，在 570nm 下檢測(cè)吸光值；而 NAD+
可被乙醇脫氫酶還原為
NADH，進(jìn)一步采用 MTT還原法檢測(cè)。 
需自備的儀器和用品 
可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、移液器、1 mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。 
試劑的組成和配制 
酸性提取液：液體 50mL×1瓶，4℃保存； 
堿性提取液：液體 50mL×1瓶，4℃保存； 
試劑一：液體15 mL×1瓶，4℃保存；   
試劑二：液體4 mL×1瓶，4℃保存； 
試劑三： 粉劑×1 瓶， -20 ℃保存， 用時(shí)加入4mL蒸餾水， 混勻， 用不完的試劑4℃保存一周； ；  
試劑四：粉劑×1 瓶，4 ℃保存，用時(shí)加入 4mL蒸餾水，混勻，用不完的試劑 4℃保存一周； ；  
試劑五：液體1.8mL×1 支，4 ℃保存； 
試劑六：液體30mL×1瓶，4 ℃保存； 
試劑七：液體50mL×1瓶，4 ℃保存。 
NAD+
和NADH的提取 
1  血清（漿）中 NAD+
和 NADH的提取 
NAD
+
的提?。喊凑昭澹{）體積（mL） ：酸性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建
議取約 0.1mL 血清（漿），加入 1mL 酸性提取液） ，煮沸 5min（蓋緊，以防止水分散失） ；
冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取上清液至另一新的離心管中，加入等體積的堿性
提取液使之中和，混勻，10000g 4  ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。 
NADH 的提?。喊凑昭澹{）體積（mL） ：堿性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建
議取約 0.1mL 血清（漿），加入 1mL 堿性提取液） ，煮沸 5min（蓋緊，以防止水分散失） ；
冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取上清液至另一新的離心管中，加入等體積的酸性
提取液使之中和，混勻，10000g 4  ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。 
2 組織中 NAD+
和 NADH的提取： 
NAD
+
的提?。喊凑战M織質(zhì)量（g） ：酸性提取液體積（mL）為 1：5~10的比例（建議取約 0.1g
組織，加入1mL酸性提取液） ，冰浴研磨，煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失） ；冰浴中冷
卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取上清液至另一新的離心管中，加入等體積的堿性提取液使
之中和，混勻，10000g 4  ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。 
NADH 的提?。喊凑战M織質(zhì)量（g） ：堿性提取液體積（mL）為 1：5~10的比例（建議取約 0.1g
組織，加入1mL堿性提取液） ，冰浴研磨，煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失） ；冰浴中冷
卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取上清液至另一新的離心管中，加入等體積的酸性提取液使
之中和，混勻，10000g 4  ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。 
3  細(xì)胞或細(xì)菌中 NAD+
和 NADH的提取： 
NAD
+
的提?。合仁占?xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104
個(gè)）：酸性
提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL酸性提取液），
超聲波破碎 1min（冰浴，強(qiáng)度 20％或 200W，超聲 2s，停 1s），煮沸 5min（蓋緊，以防止
水分散失） ；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取上清液至另一新的離心管中，加入
等體積的堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。 
NADH 的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104
個(gè)）：堿
性提取液體積 （mL） 為 500~1000： 1 的比例 （建議 500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL堿性提取液），
超聲波破碎 1min（冰浴，強(qiáng)度 20％或 200W，超聲 2s，停 1s），煮沸 5min（蓋緊，以防止
水分散失） ；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取上清液至另一新的離心管中，加入
等體積的酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。 
測(cè)定步驟： 
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 570nm，蒸餾水調(diào)零。 
2、 加樣表(在 1.5mL棕色 EP管中按下表依次加樣） ： 
試劑名稱(μL)  對(duì)照管  測(cè)定管 
樣本  50  50 
試劑一  250  250 
試劑二  75  75 
試劑三  75  75 
試劑四  75  75 
試劑五  35  35 
試劑六  500  混勻，室溫避光靜置20min 
試劑六    500 
充分混勻，靜置 5min后，20000g，常溫離心 5min，棄上清，沉淀中加入： 
試劑七  1000  1000 
混勻，570nm下比色，讀取對(duì)照吸光值 A1 和測(cè)定管吸光值A(chǔ)2，計(jì)算△A=A2-A1。 
注意事項(xiàng) 
1、如果一次性測(cè)定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。 
2、對(duì)照管和測(cè)定管的測(cè)定步驟的區(qū)別：對(duì)照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加
試劑六；測(cè)定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應(yīng)20min后再加試劑六。 
3、反應(yīng)過程中注意避光。 
4、由于每一個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管，本試劑盒 50管保證測(cè) 24個(gè) NAD+
或 NADH.。 
NAD+和NADH含量的計(jì)算 
（一）NAD+
含量的計(jì)算 
1、血清（漿）中 NAD+
含量計(jì)算 
NAD+
含量(nmol/mL）=[ (△A -0.099）×36.1×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 722×(△A -0.099） 
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NAD+
含量計(jì)算 
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算 
NAD+
 (nmol/mg prot）=[ (△A -0.099）×36.1×V1)]÷(V1×Cpr)= 36.1×(△A -0.099）÷Cpr 
(2)按樣本鮮重計(jì)算 
NAD+
 (nmol/g 鮮重）= [ (△A -0.099）×36.1×V1)]÷(W×V1÷V2)= 72.2×(△A -0.099）÷W 
  (3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算 
NAD+
 (nmol/104
 cell）=[ (△A -0.099）×36.1×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.1444×(△A -0.099） 
（二）NADH含量的計(jì)算 
1、血清（漿）中 NADH 含量計(jì)算 
NADH 含量(nmol/mL）= [ (△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 494×(△A -0.065） 
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADH含量計(jì)算 
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算 
NADH (nmol/mg prot）= [ (△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(V1×Cpr)= 24.7×(△A -0.065）÷Cpr 
(2)按樣本鮮重計(jì)算 
NADH (nmol/g 鮮重）= [ (△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 49.4×(△A -0.065）÷W 
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算 
NADH (nmol/104
 cell）= [ (△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0988×(△A -0.065） 
V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05mL；V2：加入提取液體積，2mL；V3：加入血清（漿）
體積：0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；  W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，
500 萬。 
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