如何進(jìn)行基因組DNA的提取

【資料簡介】

基因組DNA的提取通常用于構(gòu)建基因組文庫、southern雜交(包括RFLP)及PCR分離基因等。利用基因組DNA較長的特性,可以將其與細(xì)胞器或質(zhì)粒等小分子DNA分離。加入一定量的異丙醇或乙醇，基因組的大分子DNA即沉淀形成纖維狀絮團(tuán)飄浮其中, 可用玻棒將其取出，而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部, 從而達(dá)到提取的目的。在提取過程中,染色體會發(fā)生機(jī)械斷裂,產(chǎn)生大小不同的片段,因此分離基因組DNA時(shí)應(yīng)盡量在溫和的條件下操作,如盡量減少酚/氯仿抽提、混勻過程要輕緩, 以保證得到較長的DNA。一般來說,構(gòu)建基因組文庫, 初始DNA長度必須在100kb以上,否則酶切后兩邊都帶合適末端的有效片段很少。而進(jìn)行RFLP和PCR分析, DNA長度可短至50kb, 在該長度以上,可保證酶切后產(chǎn)生RFLP片段(20kb以下),并可保證包含PCR所擴(kuò)增的片段(一般2kb以下)。 
不同生物（植物、動(dòng)物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同; 不同種類或同一種類的不同組織因其細(xì)胞結(jié)構(gòu)及所含的成分不同，分離方法也有差異。在提取某種特殊組織的DNA時(shí)必須參照文獻(xiàn)和經(jīng)驗(yàn)建立相應(yīng)的提取方法, 以獲得可用的DNA大分子。尤其是組織中的多糖和酶類物質(zhì)對隨后的酶切、PCR反應(yīng)等有較強(qiáng)的抑制作用,因此用富含這類物質(zhì)的材料提取基因組DNA時(shí), 應(yīng)考慮除去多糖和酚類物質(zhì)。 
本實(shí)驗(yàn)以水稻幼苗(禾本科)、李(蘋果)葉子、動(dòng)物肌肉組織和大腸桿菌培養(yǎng)物為材料,學(xué)習(xí)基因組dna提取的一般方法。 
第二節(jié) 從植物組織提取基因組DNA 
一、材料 
水稻幼苗或其它禾本科植物，李（蘋果）幼嫩葉子。 
二、設(shè)備 
移液器，冷凍高速離心機(jī)，臺式高速離心機(jī)，水浴鍋，陶瓷研缽，50ml離心管（有蓋）及5ml和1.5ml離心管，彎成鉤狀的小玻棒。 
三、試劑 
1、提取緩沖液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。 
2、提取緩沖液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸鈉，6.0gPVP，240ul巰基乙醇，加水至300ml。 
3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 
4、 RnaseA母液：配方見*章。 
5、其它試劑：液氮、異丙醇、TE緩沖液，無水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。 
四、操作步驟： 
（一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因組DNA提取 
1. 在50ml離心管中加入20ml提取緩沖液Ⅰ, 60℃水浴預(yù)熱。 
2. 水稻幼苗或葉子5-10g, 剪碎, 在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預(yù)熱的離心管中, 劇烈搖動(dòng)混勻, 60℃水浴保溫30-60分鐘(時(shí)間長,DNA產(chǎn)量高), 不時(shí)搖動(dòng)。 
3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 顛倒混勻(需帶手套, 防止損傷皮膚)，室溫下靜置5-10分鐘, 使水相和有機(jī)相分層(必要時(shí)可重新混勻)。 
4. 室溫下5000rpm離心5分鐘。 
5. 仔細(xì)移取上清液至另一50ml離心管,加入1倍體積異丙醇,混勻,室溫下放置片刻即出現(xiàn)絮狀DNA沉淀。 
6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用鉤狀玻璃棒撈出DNA絮團(tuán),在干凈吸水紙上吸干,轉(zhuǎn)入含TE的離心管中,DNA很快溶解于TE。 
7. 如DNA不形成絮狀沉淀,則可用5000rpm離心5分鐘, 再將沉淀移入TE管中。這樣收集的沉淀,往往難溶解于TE,可在60℃水浴放置15分鐘以上，以幫助溶解。 
8. 將DNA溶液3000rpm離心5分鐘, 上清液倒入干凈的5ml離心管。 
9. 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分鐘, 除去RNA(RNA對DNA的操作、分析一般無影響，可省略該步驟）。
10. 加入1/10體積的3mol/L NaAc及2×體積的冰乙醇,混勻,-20℃放置20分鐘左右,DNA形成絮狀沉淀。 
11. 用玻棒撈出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干凈吸水紙上吸干。