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引物延伸實(shí)驗(yàn)

2015年05月26日 12:49:54人氣:163來(lái)源:上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司

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關(guān) 鍵 詞引物延伸實(shí)驗(yàn)
【資料簡(jiǎn)介】

實(shí)驗(yàn)材料    RNA
試劑、試劑盒    T4多核苷酸激酶dATP醋酸鈉乙醇EDTARNaseA*氯仿
儀器、耗材    恒溫培養(yǎng)箱NAP-5柱-70°C冰箱低溫離心機(jī)
實(shí)驗(yàn)步驟    
1.  依次加入下列試劑,建立用以標(biāo)記引物的反應(yīng)混合液(終體積10 μl)

(1)2.5 μl  H2O

(2)1 μl  10×T4多核苷酸激酶緩沖液

(3)1 μl  0.1 mol/l DTT

(4)1 μl  1 mol/l 亞精胺

(5)1 μl  50~100 ng/μl 掛核苷酸引物

(6)3 μl  10 μCi/μl[γ-32P]ATP

(7)0.5 μl  20~30 U/μl T4多核苷酸激酶

(8)37℃溫育1 h。

2.  加入2 μl 0.5 mol/l EDTA和50 μl TE緩沖液終止反應(yīng),于65℃溫育5 min。

3.  用硅化過(guò)的1 000 μl 吸頭塞上玻璃棉作成一小離子交換拄,加入20 μl AG 50W-X8樹脂和100 μl DE-52樹脂,以1 ml TEN緩沖液洗柱。

4.  將步驟2的標(biāo)記反應(yīng)物加入柱子,收集流出液重復(fù)上柱。
 
5.  用1 ml,TEN100緩沖液洗柱,然后以0.5 ml TEN300洗,棄洗脫液。
 
6.  以0.4 ml TEN600緩沖液洗脫標(biāo)記寡核苷酸引物,收集流出液,在有合適屏蔽的容器中保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

7.  取RNA樣品在微量離心管中將下列物質(zhì)混合(終體積15 μl):

(1)10 μl  細(xì)胞總RNA

(2)1.5 μl 10×雜交液

(3)3.5 μl  放射性標(biāo)記寡核苷酸

(4)確保微量離心管密封,并將其淹沒(méi)在65 ℃水洛中90 min,取出在空溫中慢慢冷卻。

8.  在冰浴的微量離心管中加入以下延伸反應(yīng)混合液(終體積每個(gè)RNA樣品30.33 μl):

(1)0.9 μl  1mol/l Tris·Cl緩沖液,pH8.3

(2)0.9 μl  0.5 mol/l MgCl2 

(3)0.25 μl  1 mol/l DTT

(4)6.75 μl  1 mg/ml *

(5)1.33 μl  5 mmol/l 4dNTP混合液

(6)20 μl  H2O

(7)0.2 μl  25 U/μl AMV反轉(zhuǎn)錄酶
 
9.  在含有RNA及寡核苷酸的微量離心管中,加入30 μl 上述延伸反應(yīng)混合物,42℃溫育1 h。
 
10.  在毎個(gè)微量離心管中加入105 μl RNA酶反應(yīng)混合物,于37 ℃育15 min。

11.  加入15 μl 3 mol/l 乙酸鈉和150 μl 酚/氯仿/異戊醇抽提,將上層水相移入一個(gè)干凈管子中,再加入300 μl 乙醇沉淀DNA,沉淀物以100 μl 70%乙醇洗滌,用吸管吸去微量的乙醇?xì)堄啵恋砹栏?~10 min。

12.  用5 μl 終止/加樣染料液重溶沉淀,65℃水浴加熱5 min,在9%丙烯酰胺/7 mol/l 尿素凝膠中電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠的底部。

13.  干燥凝膠并用增感屏放射自顯影。

上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司作者

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