引物延伸實(shí)驗(yàn)

【資料簡(jiǎn)介】

實(shí)驗(yàn)材料    RNA
試劑、試劑盒    T4多核苷酸激酶dATP醋酸鈉乙醇EDTARNaseA*氯仿
儀器、耗材    恒溫培養(yǎng)箱NAP-5柱-70°C冰箱低溫離心機(jī)
實(shí)驗(yàn)步驟    
1.  依次加入下列試劑，建立用以標(biāo)記引物的反應(yīng)混合液（終體積10 μl）

（1）2.5 μl  H2O

（2）1 μl  10×T4多核苷酸激酶緩沖液

（3）1 μl  0.1 mol/l DTT

（4）1 μl  1 mol/l 亞精胺

（5）1 μl  50~100 ng/μl 掛核苷酸引物

（6）3 μl  10 μCi/μl［γ-32P］ATP

（7）0.5 μl  20~30 U/μl T4多核苷酸激酶

（8）37℃溫育1 h。

2.  加入2 μl 0.5 mol/l EDTA和50 μl TE緩沖液終止反應(yīng)，于65℃溫育5 min。

3.  用硅化過(guò)的1 000 μl 吸頭塞上玻璃棉作成一小離子交換拄，加入20 μl AG 50W-X8樹脂和100 μl DE-52樹脂，以1 ml TEN緩沖液洗柱。

4.  將步驟2的標(biāo)記反應(yīng)物加入柱子，收集流出液重復(fù)上柱。
 
5.  用1 ml，TEN100緩沖液洗柱，然后以0.5 ml TEN300洗，棄洗脫液。
 
6.  以0.4 ml TEN600緩沖液洗脫標(biāo)記寡核苷酸引物，收集流出液，在有合適屏蔽的容器中保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

7.  取RNA樣品在微量離心管中將下列物質(zhì)混合（終體積15 μl）：

（1）10 μl  細(xì)胞總RNA

（2）1.5 μl 10×雜交液

（3）3.5 μl  放射性標(biāo)記寡核苷酸

（4）確保微量離心管密封，并將其淹沒(méi)在65 ℃水洛中90 min，取出在空溫中慢慢冷卻。

8.  在冰浴的微量離心管中加入以下延伸反應(yīng)混合液（終體積每個(gè)RNA樣品30.33 μl）：

（1）0.9 μl  1mol/l Tris·Cl緩沖液，pH8.3

（2）0.9 μl  0.5 mol/l MgCl2 

（3）0.25 μl  1 mol/l DTT

（4）6.75 μl  1 mg/ml *

（5）1.33 μl  5 mmol/l 4dNTP混合液

（6）20 μl  H2O

（7）0.2 μl  25 U/μl AMV反轉(zhuǎn)錄酶
 
9.  在含有RNA及寡核苷酸的微量離心管中，加入30 μl 上述延伸反應(yīng)混合物，42℃溫育1 h。
 
10.  在毎個(gè)微量離心管中加入105 μl RNA酶反應(yīng)混合物，于37 ℃育15 min。

11.  加入15 μl 3 mol/l 乙酸鈉和150 μl 酚/氯仿/異戊醇抽提，將上層水相移入一個(gè)干凈管子中，再加入300 μl 乙醇沉淀DNA，沉淀物以100 μl 70%乙醇洗滌，用吸管吸去微量的乙醇?xì)堄啵恋砹栏?~10 min。

12.  用5 μl 終止/加樣染料液重溶沉淀，65℃水浴加熱5 min，在9%丙烯酰胺/7 mol/l 尿素凝膠中電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠的底部。

13.  干燥凝膠并用增感屏放射自顯影。