Feulgen反應(yīng)原理及Sohiff液的配制

【資料簡介】

Feulgen 反應(yīng)原理及 Sohiff 液的配制

 

    Feulgen 反應(yīng)是顯示DNA的經(jīng)典而特異的染色方法，由Feulgen(孚爾根)在1924年提出，因而得名。

(一)Feulgen反應(yīng)原理

    DNA 可在酸性條件下水解，嘌呤―脫氧核糖之間的糖苷鍵斷開，形成醛基(―CHO)，再用  顯示醛基的特異性試劑Schiff試劑處理，形成光鏡下所見的細胞核內(nèi)紫紅色反應(yīng)產(chǎn)物。DNA  經(jīng)處理而水解。除可破壞脫氧核糖與嘌呤堿外，還可水解嘧啶堿。酸水解核酸的程度與  水解時間長短有關(guān)，隨著水解時間的延長，嘌呤堿基增多，形成的醛基也隨之增多，F(xiàn)eulgen反應(yīng)加強。如果水解時間過長，DNA將*水解，反而使Feulgen反應(yīng)減弱。DNA水解時間因組織種類和固定液不同而異，需通過預實驗找到合適的水解溫度和時間。由于Schiff試劑能與醛基結(jié)合，故不能用含醛的固定液固定組織，常用Carnoy固定液。Bouin液不適用于Feulgen反應(yīng)，因為固定液中含較多的酸，可將DNA水解，影響染色反應(yīng)。

    Schiff試劑是顯示醛基的特異試劑，其反應(yīng)原理是堿性品紅(為紅紫色)經(jīng)亞硫酸處理后變?yōu)槲迳玈chiff液，Schiff液遇到醛基時，則被還原形成原有的顏色，即紅紫色。堿性品紅結(jié)構(gòu)中的醌基是堿性品紅中具有紫紅色的核心結(jié)構(gòu)，經(jīng)亞硫酸處理后，則醌基兩端的雙鍵打開，形成五色品ii-硫酸復合物為Schiff試劑。如果加熱使SO₂逸出，則恢復品紅原來的顏色而失去對DNA的染色效果，故配好的Schiff試劑應(yīng)避免SO₂ 逸出。

Feulgen反應(yīng)原理

（二）Sohiff液的配制

    將lg堿性品紅溶于200ml煮沸的蒸餾水中，使其*溶解，然后冷卻到60℃過濾。加入30ml 1N HCl和3g焦亞硫酸鉀(K：S：()；)或亞硫酸鈉，塞緊瓶塞，置于暗處或外包黑紙24小時。1N HCl與焦亞硫酸鹽生成的SO：將溶液中堿性品紅脫色成為無色堿性品紅(即白亞磺酸)。如溶液尚有淺黃色，可用0．5g活性炭脫色，搖動幾分鐘后迅速用粗濾紙過濾．濾液應(yīng)為清亮五色。制成的Schiff試劑應(yīng)置于棕色瓶中，瓶塞需擰緊并用黑紙包裹，避光保存于4℃，保質(zhì)期可達半年。若暴露于空氣，或加熱則使Schiff試劑中的S0₂ 逸出，變性的Schiff試劑則不能使用。除堿性品紅外。其他堿性染料也可制成能與醛基反應(yīng)的類似Schie  反應(yīng)液，但是。不能達到五色。在染色時可用l％鹽酸乙醇洗去不起反應(yīng)的余色。Schiff試劑在不同的pH條件下可顯示不同的物質(zhì)，如Sehiff試劑在pH 3．0～4．3時，對Feulgen反應(yīng)效果好，而pH 2．4時，對PAS(糖原)反應(yīng)效果好。

    注意：Schiff試劑雖無色，但氧化后為紫紅色。同時要防止污染環(huán)境，用后要回收。