大腸桿菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

【資料簡介】

大腸桿菌轉(zhuǎn)化可以：（1）將重組DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌受體細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制，增殖和表達(dá)，以獲得目的基因；（2）驗(yàn)證大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞效果；（3）用于分子生物學(xué)其他研究。
實(shí)驗(yàn)材料    大腸桿菌
試劑、試劑盒    CaCl2氨芐*LB
儀器、耗材    離心機(jī)分光光度計(jì)搖床
實(shí)驗(yàn)步驟    
1.  接種—個(gè)單菌落于50 ml LB培養(yǎng)液中，于37℃搖床培養(yǎng)（250 r/min）。

2.  往一個(gè)2 L 的燒瓶中加入400 ml LB培養(yǎng)液，再加入4  ml 培養(yǎng)液，于37℃；搖床，培養(yǎng)至OD590為0.375。

3.  將培養(yǎng)液分裝到8個(gè)50 ml 預(yù)冷無菌的聚丙烯管中，于冰上放置5~10 min，然后于4℃，1 600 g 離心7 min。
 
4.  細(xì)胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl2“溶液重懸，于4℃，以1 100 g 離心5 min 。

5.  細(xì)胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl2溶液重懸，冰上放置30 min，于4℃，1 100 g 離心5 min。
 
6.  用2 ml  冰冷的CaCl2溶液重懸各管細(xì)胞，然后按每管250 μl 的量分裝于預(yù)冷的無菌聚丙烯管中，立即凍存于- 70℃。

7.  按照以下各步驟用10 ng pBR322轉(zhuǎn)化100 μl 感受態(tài)細(xì)菌。

8.  將合適體積的轉(zhuǎn)化物涂于含有氨芐*的LB平板上，37℃培養(yǎng)。

9.  將10 ng 加入到一個(gè)15 ml 無菌的圓底試管中，并放置冰上。

10.  將盛有感受態(tài)細(xì)胞菌的管子握在手上使菌液迅速熔化。

11.  立即將100 μl 感受態(tài)細(xì)菌加 入到管中，輕輕旋動(dòng)，并放置冰上10 min 。

12.  將管故入42℃水浴2 min 進(jìn)行熱休克，然后加入1 ml LB 培養(yǎng)液于每一支試管中。

13.  于37℃置滾筒式搖床口培養(yǎng)1 h。

14.  將幾個(gè)稀釋度菌液涂布于含合適抗生素的平板上，于37℃培養(yǎng)12~16 h。