正常小鼠原代骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)

【資料簡介】

正常小鼠原代骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)
 
一、實(shí)驗(yàn)試劑
1、培養(yǎng)基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement
2、凍存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO
3、洗滌液： 1 × PBS （pH 7.4 ）+ 1% P/S
4、染色液： 0.4% Trypan Blue
5、消化液： PriCells Isolation of Primary Cell Kit
6、檢測試劑：鼠抗人及大鼠desmin一抗，肌球蛋白（myosin）單克隆抗體
 
二、實(shí)驗(yàn)器械
1、培養(yǎng)皿
2、培養(yǎng)瓶
3、直剪和眼科剪
4、和
5、燒杯
6、15ml離心管
 
三、實(shí)驗(yàn)流程
取肌肉于平皿，Hank’s洗3次
↓
剔除脂肪、結(jié)締組織
↓
肌肉標(biāo)本剪約0.1cm3小塊
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移至離心管，Hank’s洗3次
↓
靜置1min，棄去上層液及漂浮組織
↓
0.25%，37度水浴消化20min，每5min搖動(dòng)或吹打1次
↓
生長培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打，依次100，200，400目過篩
↓
離心，1000rmp,10min，棄去上清
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重懸，計(jì)數(shù)細(xì)胞，接種密度以5 × 105 個(gè)/ml
↓
懸液加入未經(jīng)PPL包被培養(yǎng)瓶中，差速貼壁去除成纖維細(xì)胞，37度，1h
↓
轉(zhuǎn)移包被瓶中，生長培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)37℃，5%CO2
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4d換液，以后每天換
 
四、實(shí)驗(yàn) 操作
 
1、  新生小鼠拉頸椎處死，乙醇消毒腿部，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，取肌肉于平皿，Hank’s洗3次，剔除脂肪、結(jié)締組織，將肌肉標(biāo)本剪約0.1cm3小塊；
2、  將剪碎的肌肉移至離心管，Hank’s洗3次，靜置1min，棄去上層液及漂浮組織
3、  向上述離心管中加入0.25%，37度水浴消化20min，每5min搖動(dòng)或吹打1次離心管，然后加入生長培養(yǎng)基終止消化；
4、  反復(fù)吹打后，依次100，200，400目過篩，濾液收集后，1000r/min離心10min；
5、  棄去清夜，用生長培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，懸液加入未經(jīng)PPL包被的培養(yǎng)瓶中，差速貼壁去除成纖維細(xì)胞，37度培養(yǎng)1h后，轉(zhuǎn)移包被瓶中，生長培養(yǎng)基培養(yǎng)，4d換液，以后每天換液1次。
 
五、細(xì)胞鑒定
 
1、顯微鑒定：剛分離出的原代細(xì)胞比較小，呈球形，折光性強(qiáng)。12h后，細(xì)胞開始貼壁，72h后貼壁*，細(xì)胞逐漸延展成梭形，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞增殖、遷移并逐漸規(guī)律性地沿一個(gè)方向排列。當(dāng)細(xì)胞融合80%以上后，開始形成肌管。
 
2、免疫細(xì)胞化學(xué)染色1：肌衛(wèi)星細(xì)胞胞漿中含有結(jié)蛋白（desmin），可采用鼠抗人及小鼠desmin一抗對(duì)衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行免疫染色鑒定。
 
3、免疫細(xì)胞化學(xué)染色2：采用骨骼肌特異性的肌球蛋白（myosin）單克隆抗體檢測。取含骨骼肌細(xì)胞蓋玻片常規(guī)處理后進(jìn)行myosin的細(xì)胞免疫化學(xué)染色，PBS代替一抗做陰性對(duì)照。結(jié)果判定：以細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色。
 
六、注意事項(xiàng)
 
1、消化過程中，也可采用15min兩步消化的方法進(jìn)行。根據(jù)所取組織個(gè)體年齡決定，一般成年大小鼠采用兩步消化效果好，幼鼠一步消化和兩步消化差別不大。
 
2、傳代培養(yǎng)代數(shù)不要太多，骨骼肌細(xì)胞傳代能力有限，容易死亡。
 
3、骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)過程中，形態(tài)會(huì)發(fā)生較大變化。
 
4、肌肉組織要盡可能剔除表面的膜和脂肪組織。