簡易過碘酸鈉法具體操作步驟

【資料簡介】

簡易過碘酸鈉法 本法是以NaIO４先將HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再與Ig上的氨基相結合，所 獲酶標記抗體的產率高，將近70％的HRP和Ig結合，99％的Ig與酶結合，酶與Ig的活性無重 大損失，是目前zui常用的方法。

1. 原理：經典的過碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的α-和ε氨基基以 避免酶分子之間的交聯。后來Wilson等改用在低PH下使NaIO４氧化HRP，從而省去了二硝 基氟苯封閉HRP步驟。HRP經NaIO４氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成 斯夫氏鹼，后者可進一步用NaBH４(或乙醇胺)還原穩(wěn)定的酶標記抗體。

2. 標記步驟: (1) 稱取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中。

(2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。

(3) 將上述溶液裝入透析袋中，對1mM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過一夜。

(4) 加20μl 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立 即加入10mg IgG(抗體，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小 時。

(5) 加0.1ml新配的4mg／ml NaBH４液，混勻，再置4℃2小時。

(6) 將上述液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4 PBS透析，4℃過夜。 其余步驟(純化)同戊二醛標記步驟的(6)、(7)、(8)。

3. 結果判定： 除標記物IgG量的計算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。 IgG量(mg／ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62