腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶

【資料簡(jiǎn)介】

測(cè)定意義

AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中，催化葡萄糖-1-磷酸與ATP反應(yīng)生成淀粉合成的直接前體ADPG，是植物淀粉生物合成的主要限速步驟。

測(cè)定原理

AGP催化的逆向反應(yīng)生成G1P，在反應(yīng)體系中添加的磷酸己糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，340nm下測(cè)定NADPH增加速率，即可計(jì)算AGP活性。

需自備的的儀器和用品

紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水

試劑的組成和配制

提取液：液體30mL×1瓶，4℃保存;

試劑一：液體10mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1支，4℃保存；臨用前加入250μL雙蒸水充分溶解備用；用不完的試劑仍4℃保存；

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入2mL雙蒸水充分溶解備用；用不完的試劑仍4℃保存；

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入3mL雙蒸水充分溶解備用；用不完的試劑仍4℃保存；

試劑五：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入3mL雙蒸水充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存；

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加入250μL雙蒸水充分溶解備用；用不完的試劑4℃保存；

試劑七：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加入250μL雙蒸水充分溶解備用；用不完的試劑4℃保存；

粗酶液制備

稱取約0.1g組織加入1mL提取液，冰浴中勻漿。10000g ，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

測(cè)定步驟（在1.5mL EP管中依次加入下列試劑）：

試劑名稱（μL）	測(cè)定管
試劑一	100
試劑二	10
試劑三	50
試劑四	100
樣本	20

混勻，30℃保溫15 min，置沸水浴中1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴迅速冷卻

試劑五	100
試劑一	300
試劑六	10
試劑七	10

混勻后立即在340 nm波長(zhǎng)下記錄初始吸光度A1和 2min后的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

 

AGP活性計(jì)算

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活性單位。

AGP活性（U/mg prot）＝反應(yīng)總體積（700μL ）÷樣本體積（20μL ）÷反應(yīng)時(shí)間(2min)÷NADPH消光系數(shù)（6.22×10^-3）×ΔA÷蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=2813×ΔA÷蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）。

此法需要自行測(cè)定粗酶液蛋白質(zhì)濃度。

2、按照樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

AGP活性（U/g 鮮重）=反應(yīng)總體積（700μL ）÷樣本體積（20μL ）÷反應(yīng)時(shí)間(2min)÷NADPH消光系數(shù)（6.22×10^-3）×ΔA ÷樣本鮮重(g/mL) =2813×ΔA÷樣本鮮重(g/mL)