上海酶聯(lián)生物研究所作者
*消化方法的改進(jìn)
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上 傳 人 | 上海酶聯(lián)生物研究所 | 需要積分 | 0 |
關(guān) 鍵 詞 | *消化方法的改進(jìn),*消化方法的改進(jìn),*消化方法的改進(jìn),*消化方法的改進(jìn) |
- 【資料簡介】
實踐出真知,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的金丹總結(jié)了多個細(xì)胞的消化經(jīng)驗,對*消化方法進(jìn)行了改進(jìn)。
背景:對于絕大多數(shù)實驗室培養(yǎng)的用作模型的細(xì)胞來說,細(xì)胞傳代是一項*的工作,常用的傳代方法為:向長滿了細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中加入足量*浸泡消化細(xì)胞一段時間后再分散細(xì)胞并傳代。但是各種細(xì)胞對*的敏感度千差萬別,有的細(xì)胞比如HEK293系列的極容易消化,而有些如RAW264.7幾乎不能被*從瓶壁上消化下來。消化時間不夠,后續(xù)的細(xì)胞分散就需要用機械力,這樣對細(xì)胞損傷太大,而且往往達(dá)不到很好的效果;消化過度,則會引起某些敏感的細(xì)胞的死亡,對于廣大新手來說,在培養(yǎng)細(xì)胞時*的消化程度很難把握。
方法改進(jìn):
1. *消化:細(xì)胞長滿后,棄培養(yǎng)基,用無菌PBS或者0.25%的*溶液適量浸洗細(xì)胞一次,浸洗的目的是去除生活藏培養(yǎng)基中的血清等抑制*活性的物質(zhì),洗完后棄凈洗液,再次用0.25%的*溶液潤洗一次,洗完后小心丟棄洗液,此時瓶內(nèi)還會殘留很少的*溶液,蓋好細(xì)胞瓶塞,放入培養(yǎng)箱進(jìn)行消化直到對光可見明顯的細(xì)胞間隙增大,瓶內(nèi)變圓細(xì)胞開始整體脫落,此時加入生長培養(yǎng)基終止消化,后續(xù)輕微用移液器吹打即可很好的分散細(xì)胞。
2. 有些實驗室采用添加EDTA的方法增加*的消化能力,但是添加的EDTA會大量螯合體系中的二價離子,如Ca2+,如此會導(dǎo)致細(xì)胞尤為環(huán)境及胞內(nèi)離子的大量流失,容易對細(xì)胞照成更大的損傷。因此,本人改進(jìn)的方法中不使用添加EDTA的*消化液。
3. 對于本身貼壁不牢但是又容易聚集生長的細(xì)胞,典型的例子就是HEK293,方法可以改進(jìn)為:采用上述殘液消化,但是在放入37度培養(yǎng)箱消化時培養(yǎng)瓶倒置,適當(dāng)延長消化時間(HEK293:5-8min);因為無論是直接倒出還是用吸管吸,培養(yǎng)瓶內(nèi)殘留的*還是很多,這類細(xì)胞極易從瓶壁上大塊脫落后,在*溶液里面形成團狀,極難被消化分散。
4. 對RAW264.7這類極難用*消化的細(xì)胞,可采用的改進(jìn)方法如下:第二次用*浸洗時延長時間至5-10min,之后倒出*,剩余殘液繼續(xù)放回培養(yǎng)箱中進(jìn)行消化10-15min,此時細(xì)胞可很容易的被吹打分散均勻。
結(jié)果:本實驗室培養(yǎng)了COS7,HEK293,NIH3T3,HepG2,RAW264.7以及原代細(xì)胞等多種生長特性的細(xì)胞,從貼壁不牢固的COS7,HEK293等細(xì)胞到一般用細(xì)胞刮刀傳代的RAW264.7,現(xiàn)在基本都采用這種傳代方法,在傳代培養(yǎng)是可以獲得很好的單細(xì)胞懸液,對細(xì)胞的損害也比以前的方法(浸泡消化,添加EDTA)小很多,細(xì)胞生長狀態(tài)良好。
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