冷凍保存法：適用于抗凍力強的微生物。這些微生物可在其菌體細胞外遭受凍結(jié)的情況下而不受損傷，而對其它大多數(shù)微生物而言，無論在細胞外凍結(jié)還是在細胞內(nèi)凍結(jié)，都會對菌體造成損傷，因此當采用這種保藏方法時，應(yīng)注意以下幾點，

① 要選擇適于冷凍干燥的菌齡細胞；

② 要選擇適宜的培養(yǎng)基，因為某些微生物對冷凍的抵抗力，常隨培養(yǎng)基成分的變化而顯示出巨大差異；

③ 要選擇合適的菌液濃度，通常菌液濃度越高，生存率越高，保存期也越長；

④ 在菌液內(nèi)不添加電解質(zhì)（如食鹽等）；

⑤ 可在菌液內(nèi)添加甘油等保護劑，以防止在冷凍過程中出現(xiàn)菌體大量死亡的現(xiàn)象。同樣，也可添加各種糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護效果的溶劑，但對有些微生物而言，不加保護劑時更有效。

⑥ 原則上應(yīng)盡快進行冷凍處理，但當加入保護劑時，可靜置一段時間后再進行處理。

⑦ 就動物細胞而言，應(yīng)在－20℃范圍內(nèi)以℃/min左右的速度緩慢降溫，此后必須盡快降到貯藏溫度；而對絕大多數(shù)微生物而言，則不必如此，如結(jié)構(gòu)較為復雜的原蟲則可在－35℃范圍內(nèi)進行緩慢降溫，而噬菌體則必需采用上述的二階段法進行冷凍；

⑧ 若進行保存，則貯藏溫度越低越好；

⑨ 取用冷凍保存的菌種時，應(yīng)采取速融措施，即在35～40℃溫水中輕輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來說，則應(yīng)選擇靜置融化的措施。當冷凍菌融化后，應(yīng)盡量避免再次冷凍，否則菌體的存活率將顯著下降。細胞