一.*，要用Western Blot比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達量的相對多少，前提條件是等量的蛋白上樣，才有比較的基礎。特別是在表達量不高時，上樣量的差別就很可能影響結(jié)果的分析。所以需要內(nèi)參做對比。
內(nèi)參即是內(nèi)部參照（Internal Control），對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白(Housekeeping Proteins)，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。在Western Blotting 實驗中，除了需要進行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外，還需要進行內(nèi)參的檢測，以校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的實驗誤差，以保證實驗結(jié)果的準確性。
在國外發(fā)表的文章中，Western Blotting 實驗結(jié)果須進行內(nèi)參校正已成為一種慣例。但是，國內(nèi)仍有不少科研人員在Western Blotting實驗中忽略了內(nèi)參的使用，將蛋白濃度測定作為規(guī)范需相互比較的各種樣品間上樣量等同的*方法。然而各種蛋白質(zhì)濃度定量方法，都存在局限性，不能*準確的確定各種樣品的準確蛋白濃度。 蛋白質(zhì)定量以后進行電泳時需要等量上樣，此步驟也存在操作誤差。在Western blotting實驗時使用內(nèi)參，即可簡便地對定量和上樣步驟產(chǎn)生的誤差進行校正。此外使用內(nèi)參可以作為空白對照，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否*、整個Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。
實驗結(jié)果分析其實很簡單：如果樣品蛋白量有限，只夠進行一次電泳轉(zhuǎn)膜實驗時，分別檢測樣品的內(nèi)參量和目的蛋白量。將各樣品目的蛋白量分別除以其內(nèi)參含量，得到的數(shù)值即為內(nèi)參校正后的各樣品中目的蛋白相對含量，再用此數(shù)值進行樣品間的比較和分析，得到目的蛋白含量在不同樣品間的實際變化結(jié)果。如果樣品量充分，可以先檢測內(nèi)參，觀測樣品間內(nèi)參顯色條帶是否一致，根據(jù)差異大小調(diào)整各樣品的上樣量重新進行Western Blotting實驗，至內(nèi)參量一致為止；若內(nèi)參一致，即可進行不同樣品間目的蛋白表達變化分析。這樣雖然麻煩一點，但是可以保證結(jié)果更有說服力，更可信。畢竟我們的實驗是一種嚴謹?shù)墓ぷ鳌?br />二.實驗中出現(xiàn)的問題及處理辦法
1、為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象？
原因：主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的；
處理辦法：加樣前離心，選擇適當?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時間過長，重新配制;降低凝膠濃度。
2、為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象？
原因：主要是樣品不溶性顆粒引起的；
處理辦法：加樣前離心，加適量樣品促溶劑。
3、為什么電泳的條帶很粗？
原因：電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因；
處理辦法：適當增加濃縮膠的長度，保證濃縮膠貯液的pH正確（6.7），適當降低電壓。