測定蛋白質含量的常規(guī)方法介紹;

一、微量凱氏（kjeldahl）定氮法

樣品與濃硫酸共熱。含氮有機物即分解產生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經(jīng)強堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。若以*為例，其反應式如下：

NH2 CH2 COOH+3H2 SO4 ――2CO2 +3SO2 +4H2O+NH3 （1）

2NH3 +H2 SO4 ――（NH4 ）2 SO4 （2）

（NH4 ）2 SO4 +2NaOH――2H2 O+Na2 SO4 +2NH3 （3）

反應（1）、（2）在凱氏瓶內完成，反應（3）在凱氏蒸餾裝置中進行。

為了加速消化，可以加入CuSO4作催化劑，K2SO4以提高溶液的沸點。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強酸。實驗和計算方法這里從略。

計算所得結果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白含量，應將總氮量減去非蛋白

氮即得。如欲進一步求得樣品中蛋白質的含量，即用樣品中蛋白氮乘以6．25即得。

二、雙縮脲法（biuret法）

（一）實驗原理

雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個分子氨后得到的產物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應。

紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。測定范圍為1-10mg蛋白質。干擾這一測定的物質主要有：硫酸銨、tris緩沖液和某些氨基酸等。

此法的優(yōu)點是較快速，不同的蛋白質產生顏色的深淺相近，以及干擾物質少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分的蛋白質測定。

（二）試劑與器材

1.試劑：

（1）標準蛋白質溶液：用標準的結晶牛血清清蛋白（bsa）或標準酪蛋白，配制成10mg/ml的標準蛋白溶液，可用bsa濃度1mg/ml的a280為0.66來校正其純度。如有需要，標準蛋白質還可預先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標準蛋白質溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05NaOH配制。

（2）雙縮脲試劑：稱以1.50克硫酸銅（CuSO4•5H2O）和6.0克酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6•4H2O），用500毫升水溶解，在攪拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀釋到1升，貯存于塑料瓶中（或內壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。

2.器材：

可見光分光光度計、大試管15支、旋渦混合器等。

（三）操作方法

1.標準曲線的測定：取12支試管分兩組，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的標準蛋白質溶液，用水補足到1毫升，然后加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫（20～25℃）下放置30分鐘，于540nm處進行比色測定。用未加蛋白質溶液的*支試管作為空白對照液。取兩組測定的平均值，以蛋白質的含量為橫座標，光吸收值為縱座標繪制標準曲線。

2、樣品的測定：取2～3個試管，用上述同樣的方法，測定未知樣品的蛋白質濃度。注意樣品濃度不要超過10mg/ml。