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技術(shù)文章
脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)染法
點擊次數(shù)：567 發(fā)布時間：2012-12-4
脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)染法
脂質(zhì)體（lipofectin regeant,LR）試劑是陽離子脂質(zhì)體N-[1-2，3-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium Chloride（DOTMA）和Dioleoyl photidye-thanolamine（DOPE）的混合物[1:1（w/w）]。它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中，是目前條件下zui方便的轉(zhuǎn)染方法之一。轉(zhuǎn)染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5～100倍，能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細胞。
用LR進行轉(zhuǎn)染時，首先需優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，應(yīng)找出該批LR對轉(zhuǎn)染某一特定細胞適合的用量、作用時間等，對每批LR都要做：*，先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時間，DNA可從1～5μg和孵育時間6小時開始，按這兩個參數(shù)繪出相應(yīng)LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者*的劑量，確定出轉(zhuǎn)染時間（2～24小時）。因LR對細胞有一定的毒性，轉(zhuǎn)染時間以不超過24小時為宜。
細胞種類：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一種細胞均可作為受體細胞。
一、操作步驟[方法一]：
1. 取6孔培養(yǎng)板（或用35mm培養(yǎng)皿），向每孔中加入2mL含1～2×105 個液，37℃CO2 培養(yǎng)至40%～60%匯合時（匯合過分，轉(zhuǎn)染后不利篩選細胞）。
2. 轉(zhuǎn)染液制備：在聚苯乙稀管中制備以下兩液（為轉(zhuǎn)染每一個孔細胞所用的量）A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋1-10μg DNA，終量100μL，B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋2-50μgLR，終量100μL，輕輕混合A、B液，室溫中置10-15分鐘，稍后會出現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉(zhuǎn)染（如出現(xiàn)沉淀可能因LR或DNA濃度過高所致，應(yīng)酌情減量）。
3. 轉(zhuǎn)染準備：用2mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入1mL不含血清培養(yǎng)液。
4. 轉(zhuǎn)染：把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻，37℃溫箱置6～24小時，吸除無血清轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
5. 其余處理如觀察、篩選、檢測等與其它轉(zhuǎn)染法相同。
注意：轉(zhuǎn)染時切勿加血清，血清對轉(zhuǎn)染效率有很大影響。
二、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟如下[方法二]：
1. 以5×105 細胞/孔接種6孔板（或35mm培養(yǎng)皿）培養(yǎng)24小時，使其達到50～60%板底面積。
2. 在試管中配制DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物方法如下：
①在1mL無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質(zhì)粒DNA或供體DNA。
②旋轉(zhuǎn)1秒鐘，再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉(zhuǎn)。
③室溫下放置5～10分鐘，使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體上。
3. 棄去細胞中的舊液，用1mL無血清DMEM洗細胞一次后棄去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，37℃培養(yǎng)3～5小時。
4. 再于每孔中加入20%FCS的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)14～24小時，
5. 吸出DMEM/DNA/脂質(zhì)體混合物加入新鮮10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培養(yǎng)24～48小時。
6. 用細胞刮或消化法收集細胞，以備分析鑒定。
四、穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法如下：
1. 接種細胞同前，細胞長至50%板底面積可用于轉(zhuǎn)染。
2. DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細胞同前2、3步驟。
3. 在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37℃培養(yǎng)48小時。
4. 吸出DMEM，用G418選擇培養(yǎng)液稀釋細胞，使細胞生長一定時間，篩選轉(zhuǎn)染克隆，方法參照細胞篩選法進行。