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技術(shù)文章
正常小鼠腎間質(zhì)成纖維細胞的培養(yǎng)
點擊次數(shù)：622 發(fā)布時間：2012-11-23
正常小鼠腎間質(zhì)成纖維細胞的培養(yǎng)
實驗材料：
1. 腎組織：取自8周齡健康雌性小鼠；
2. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L*、200mg/L*，pH7.2；
3. 0.1%明膠：為生長基質(zhì)成分，在取材前先用它包被培養(yǎng)瓶的生長面；
4. 消化液：0.1%*溶液；
5. 培養(yǎng)液：DMEM培養(yǎng)液，補充20%的胎牛血清、成纖維細胞生長因子（α-FGF）2μg/ml、*100μg/ml、*100IU/ml、*100μg/ml；
6. 用于細胞鑒定的抗體：抗細胞角蛋白（cytokeratin）抗體、抗角蛋白（keratin）抗體、抗波形蛋白（vimentin）抗體、抗結(jié)蛋白（des min）抗體、抗α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscular actin，α-SMA）抗體；
7. 眼科剪、*等無菌消毒手術(shù)器械；
8. 網(wǎng)篩：100目、150目；
9. 離心管（15ml、50ml）；
實驗方法：
1. 取材；
① 斷頸處死小鼠，在無菌條件下迅速取出腎臟，用生理鹽水沖洗干凈，剝離腎被膜；
② 切取腎皮質(zhì)，將皮質(zhì)*成2—3mm的細條。在100目不銹鋼網(wǎng)篩上輕輕研磨，并用生理鹽水沖洗，收集濾液。將濾液再用150目的網(wǎng)篩過濾，收集網(wǎng)篩上富含腎小管的間質(zhì)碎片；
③ 在倒置顯微鏡下觀察收集的間質(zhì)碎片，其中應主要為腎小管節(jié)段。如果混有較多的腎小球，則須將收集到的間質(zhì)碎片再放置到150目網(wǎng)篩上沖洗，直至腎小管純度達98%以上后才進行下面的步驟；
④ 用培養(yǎng)液懸浮收集的腎小管節(jié)段；
2. 接種與培養(yǎng)；
① 將腎小管節(jié)段懸液加入已用明膠包被的培養(yǎng)瓶內(nèi)。于37℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每4—5d換液一次。
② 待細胞長滿瓶壁后，用0.1%*消化傳代。每4—5d傳代一次，通常連接傳代至第三代時即可獲得較純的成纖維細胞。一般可傳10代左右；