序列測定的技術(shù)和策略
Sanger雙脫氧鏈終止法
Maxam－Gilbert DNA化學(xué)降解法
測序策略

目前應(yīng)用的兩種快速序列測定技術(shù)是Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化學(xué)降解法。雖然其原理大相徑庭，但這兩種方法都是同樣生成互相獨立的若干組帶放射性標(biāo)記的寡核苷酸，每組寡核苷酸都有固定的起點，但卻隨機(jī)終止于特定的一種或者多種殘基上。由于DNA上的每一個堿基出現(xiàn)在可變終止端的機(jī)會均等，因些上述每一組產(chǎn)物都是一些寡核苷酸混合物，這些寡核苷酸的長度由某一種特定堿基在原DNA全片段上的位置所決定。然后在可以區(qū)分長度僅差一個核苷酸的不同DNA分子的條件下，對各組寡核苷酸進(jìn)行電泳分析，只要把幾組寡核苷酸加樣于測序凝膠中若干個相鄰的泳道這上，即可從凝膠的放射自影片上直接讀出DNA上的核苷酸順序。

一、Sanger雙脫氧鏈終止法[點擊查看詳情]

二、Maxam－Gilbert DNA化學(xué)降解法

與包括合成反應(yīng)的鏈終止技術(shù)不同，Maxam-Gilbert法要對原DNA進(jìn)行化學(xué)降解。這一方法是在體外研究lac阻抑制與lac操縱基因相互作用時醞釀發(fā)展起來的。時至今日，可以探測DNA構(gòu)象的蛋白質(zhì)－DNA相到作用，仍然是Maxam- Gilbert法*的鮮明特點。在這一方法（Maxam和Gilbert，1980）中，一個末端標(biāo)記的DNA片段在5組互相獨立的的化學(xué)反應(yīng)分別得到部分降解，其中每一組反應(yīng)特異地針對某于種或某一類堿基。因此生成5組放射性標(biāo)記的分子，從共同起點（放射性標(biāo)記末端）延續(xù)到發(fā)生化學(xué)降解的位點。每組混合物中均含有長短不一的DNA分子，其長度取決于該組反應(yīng)所針對的堿基在原DNA全片段上的位置。此后，各組均通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，再通過放射自顯影來檢測末端標(biāo)記的分子。相對而言，Maxam-Gilbert法自初次提出以來，基本沒有變化。雖然設(shè)計了另一些化學(xué)降解反應(yīng)（見綜述：Ambrose和Pless，1987），但這些反應(yīng)一般只作為Maxam和Gilbert(1977，1980)zui早提出的反應(yīng)的補(bǔ)充。這一方法的成敗，*取決于上述這些佞兩步進(jìn)行的降解反應(yīng)的特異性。*步先對特定堿基（或特定類型的堿基）進(jìn)行化學(xué)修飾，而第二步修飾堿基從糖環(huán)上脫落，修飾堿基5"和3"的磷酸二酯鏈斷裂。在每種情況下，這些反應(yīng)都要在精心控制的條件下進(jìn)行，以確保每一個DNA分子平均只有一個靶堿基被修飾。隨后用哌啶裂解修飾堿基的5"和3"位置，得到一組長度從一到數(shù)百個核苷酸不等的末端標(biāo)記分子。比較G、A＋G、C＋T、C和A>C各個泳道， 右從測序凝膠的放射自顯影片上讀出DNA序列。由于種種原因（如采用32P進(jìn)行放射性標(biāo)記、末端標(biāo)記DNA的比活度、裂解位點的統(tǒng)計學(xué)分布、凝膠技術(shù)方面的局限性等等），Maxam-Gilber法所能測定的長充要比Sanger法短一些，它對放射性標(biāo)記末端250個核苷酸以內(nèi)的DNA序列效果*。在70年代Maxam-Gilbert法和Sanger法剛剛問世時，利用化學(xué)降解進(jìn)行測序不但重現(xiàn)性更高，而且也容易為普通研究人員所掌握。Sanger 法南非要單鏈模板和特異寡核苷酸的，并需獲得大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow 片段的高質(zhì)量酶制劑，而Maxam-Gilbert法只需要人所共的簡單化學(xué)試劑。但隨著M13 噬菌體和噬菌粒載體的發(fā)展，也由于現(xiàn)成的合成引物唾手可得及測序反應(yīng)日臻完善，雙脫氧鏈終止法如今遠(yuǎn)比Maxam-Gilbert法應(yīng)用得廣泛。然而，化學(xué)降解較之鏈終止法具有一個明顯的優(yōu)點：所測序列來自原DNA分子而不是酶促合成所產(chǎn)生的拷貝。因此，利用Maxam-Gilbert法可對合成的寡核苷酸進(jìn)行測序，可以分析諸如甲基化等DNA修飾的情況，不可以通過化學(xué)保護(hù)及修飾干擾實驗來研究DNA二級結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)與DNA的相互作用。然而，由于Sanger法既簡便又快速，因此是現(xiàn)今的*選擇方案。事實上，目前大多數(shù)測序策略都是為Sanger法而設(shè)計的。 類核苷酸類惟物的耐受性看來也優(yōu)于原來的測序酶。