目的
1、了解抗生素產(chǎn)生菌體外篩選法的原理。
2、學(xué)習(xí)并掌握抗生菌的鑒別方法。
原理
由土壤中分出的放線菌需進(jìn)一步鑒別是否為需要的抗生菌。首先應(yīng)根據(jù)篩選目的確定試驗(yàn)?zāi)Ｐ停缓罄门囵B(yǎng)基平板進(jìn)行拮抗性測(cè)定。常用的方法有瓊脂塊法和濾紙片法。其主要依據(jù)是擴(kuò)散原理，即觀察在抗生菌周圍是否會(huì)出現(xiàn)明顯的抑菌圈。抑菌圈的大小和透明度則表明了該菌株抗菌活性的強(qiáng)弱。本實(shí)驗(yàn)選用了這兩種方法。
儀器與材料
1、培養(yǎng)基：500ml三角瓶中分裝300ml黃豆餅粉瓊脂，18×180mm試管分裝
4ml黃豆餅粉浸汁，300ml三角瓶分裝150ml細(xì)菌培養(yǎng)基，150ml三角瓶分裝50ml馬鈴薯培養(yǎng)基。
2、試驗(yàn)菌：
（1）枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）
（2）大腸桿菌（Escherichia coli）
（3）（Staphlococcus aureus）
（4）深紅酵母（Ruodotorula rubra）
3、待測(cè)菌株：
（1）瓊脂培養(yǎng)物：將融化的黃豆餅粉瓊脂倒入無菌培養(yǎng)皿，制成平板。用記號(hào)筆在平皿背面畫一直線，將平皿一分為二，分別注明待測(cè)菌株的編號(hào)。并按照編號(hào)將待測(cè)菌株密集劃線接入平板。同法接入華美鏈霉菌（Streptomyces splendens）和鏈霉菌（Streptomyces aureofaciens）作為對(duì)照菌，28℃下培養(yǎng)7天。
（2）發(fā)酵液：將待測(cè)菌株和對(duì)照菌分別接入黃豆餅粉培養(yǎng)液，作好標(biāo)記，28℃下振蕩培養(yǎng)7天。
4、滅菌物品：培養(yǎng)皿，打孔器，鑷子，圓濾紙片，15×150mm試管分裝5ml無菌水，1ml吸管，無菌漏斗。
5、其它：接種用具，游標(biāo)卡尺，記號(hào)筆，搖床。
方法
一、瓊脂塊法
1、分別取枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和各1支，加入5ml無菌水制成菌懸液，備用。
2、取9套無菌培養(yǎng)皿，向每套培養(yǎng)皿中分別加入1ml試驗(yàn)菌懸液，然后加入約12ml冷卻至45℃左右的細(xì)菌培養(yǎng)基，迅速在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上搖勻，制成指示菌平板。每1種指示菌3個(gè)重復(fù)， 并注明指示菌及測(cè)定菌株的位置。
3、用無菌打孔器將待測(cè)菌株和對(duì)照菌的黃豆餅粉瓊脂培養(yǎng)物切塊，每種培養(yǎng)物9塊。
4、用無菌接種針，將待測(cè)菌株和對(duì)照菌瓊脂塊分別移入各指示菌平板的相應(yīng)位置上，菌面朝上，間隔均勻擺放。
5、靜置20min后，放入恒溫箱，37℃下培養(yǎng)18～24h。
6、用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，并觀察抑菌圈的透明程度和邊緣整齊程度。
二、濾紙片法
1、向深紅酵母菌斜面中加入5ml無菌水，制成菌懸液。
2、向已冷卻至45℃左右的馬鈴薯培養(yǎng)基中加入0.5ml深紅酵母菌懸液，搖勻后，倒3個(gè)指示菌平板，并在平皿背面標(biāo)明測(cè)定菌株的位置，備用。
3、過濾各測(cè)定菌株的發(fā)酵液。
4、用無菌鑷子取無菌的圓濾紙片，蘸取各測(cè)定菌株的發(fā)酵濾液，放入指示菌平板的相應(yīng)位置上，每1測(cè)定菌株3個(gè)重復(fù)。
5、靜置20min后，28℃下培養(yǎng)2天。
6、用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，并觀察抑菌圈的透明程度和邊緣整齊程度。