二．原理： 
芽孢染色法是根據(jù)細(xì)菌的芽孢和菌體對(duì)染料的親和力不同的原理，用不同的染料進(jìn)行染色，使芽孢和菌體呈不同顏色而便于區(qū)別。芽孢壁厚、透性低，著色、脫色均較困難，當(dāng)用弱堿性染料孔雀綠在加熱的情況下進(jìn)行染色時(shí)，此染料可以進(jìn)入菌體及芽孢使其著色，而進(jìn)入芽孢的染料則難以透出。若再?gòu)?fù)染（蕃紅液），則菌體呈紅色而芽孢呈綠色。 
觀察莢膜通常采用負(fù)染色法，即將菌體染色后，再使背景著色，從而把莢膜襯托出來(lái)。 
觀察鞭毛是采用在染色的同時(shí)將染料堆積在鞭毛上使它加粗的方法。細(xì)菌只有在個(gè)體發(fā)育到一定的時(shí)期才具有鞭毛，一般在多次移種之后，在其旺盛生長(zhǎng)階段染色。 

三．實(shí)驗(yàn)材料： 
1．菌種：巨大芽孢桿菌(B.megaterium)：營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)20hs 
產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aeroGENEs)：肉汁等斜面培養(yǎng)20hs 
普通變形桿菌(Proteus vulgaris)：營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)18hs 
2．染料： 
（1）芽孢染色用7.6%飽和孔雀綠液、0.5%蕃紅液（或石炭酸復(fù)紅液和呂氏美藍(lán) 
液） 
（2） 莢膜染色用剛果紅、明膠水溶液，呂氏美藍(lán)液等。 
（3） 鞭毛染色用染色液（A、B液）;或Leifson染色液（A、B、C液） 
3．其它：顯微鏡、載波片、接種環(huán)、酒精燈、香柏油、二甲苯、無(wú)菌水、 
1%鹽酸、電爐、墨汁、20%CuSO4、95%乙醇、擦鏡紙等。 

四．實(shí)驗(yàn)方法與步驟： 
（一） 芽孢染色：介紹兩種常用的方法 
1. 孔雀綠染色法：取一干凈載片按無(wú)菌法取巨大芽孢桿菌菌體少許制成涂片， 
風(fēng)干固定后，在涂菌處滴加法7.6%的孔雀綠飽和水溶液，染色10分鐘后， 
用水沖洗，再用0.5%蕃紅花紅液染色彩1分鐘，水洗，風(fēng)干后鏡檢。芽孢 
被染成綠色，營(yíng)養(yǎng)體呈紅色。 
2.石炭酸復(fù)紅染色法：在一支小試管（10*100mm）中，滴入3—4滴蒸溜水，用接種環(huán)取巨大芽孢桿菌于水中，充分?jǐn)噭颍咕w分散，制成較濃的菌懸液。然后滴加等體積的(3—4滴) 石炭酸復(fù)紅掖搖勻。將此試管放入沸水浴中煮10—15分鐘，使芽孢及菌體著色。取此菌液體2—3環(huán)在潔凈的載片上做成涂片，自然干燥通過火焰固定后，在自來(lái)水下緩緩沖洗，使菌體脫色，再用呂氏美藍(lán)液復(fù)染1—2分鐘。用水洗去多余染液，輕輕用吸水紙吸去水分，干后鏡檢，結(jié)果可見芽孢被染成紅色，菌體呈現(xiàn)藍(lán)色。 
（二）莢膜染色法 
1.方法① 
將剛果紅水溶液和明膠水溶液各一滴滴于干凈載片上；用接種環(huán)蘸取細(xì)菌培養(yǎng)液或懸浮液在載片上于上述兩滴溶液混勻，自然干燥；滴加1%HCl沖洗，使涂片呈藍(lán)色；用蒸餾水漂洗，除去HCl；，用美藍(lán)復(fù)染1分鐘，水洗，自然干燥后鏡檢。 
鏡檢：有莢膜的菌，菌體藍(lán)色，莢膜不著色，背景藍(lán)紫色；無(wú)莢膜的菌，菌體藍(lán)色，背景藍(lán)紫色。由于干燥菌體收縮，菌體四周也可能有一圈狹窄的不著色環(huán)，但這不是莢膜。莢膜不著色的部分寬。 
2.方法② 濕墨汁法 
（1）制菌液：加一滴墨汁于潔凈的波片上，并挑少量菌與其充分混合。 
（2）加蓋玻片：放一清潔蓋玻片于混合液上，然后在蓋玻片上放一張濾紙，向下 輕壓，吸收多余菌液。 
（3） 鏡檢。 
結(jié)果：背景灰色，菌體較暗，在其周圍呈現(xiàn)一明亮的透明圈即莢膜。 
3. 方法③TyLer法 
（1） 涂片：按常規(guī)法涂片，在空氣中自然干燥。 
（2） 染色：用結(jié)晶紫冰醋酸染5—7分鐘。 
（3） 用20%CuSO4水溶液洗，再用毛邊紙吸干。 
（4） 鏡檢并觀察結(jié)果：莢膜藍(lán)紫色，細(xì)胞暗藍(lán)色。 
（三〕鞭毛染色法 
1.銀鹽染色法 
（1）清洗玻片: 選擇光滑無(wú)裂痕的玻片,選用新的。為了避免玻片向后重疊，應(yīng)將玻片插在金屬架上。然后將玻片置洗衣粉濾過液中（洗衣粉先經(jīng)煮沸，再用濾紙過濾，以除去粗顆粒），煮沸20分。取出稍冷后即用自來(lái)水沖洗，晾干。再放入濃洗液中浸泡5—6天。使用前取出玻片，用水沖去殘酸，再用蒸餾水洗。將水瀝干后，放入95%乙醇中脫水。取出玻片，在火焰上燒去酒精，立即使用。 
（2）菌液的制備及涂片：用于染色的菌種應(yīng)預(yù)先連續(xù)移接5至7代。染色前用于 接菌的培養(yǎng)基應(yīng)是新鮮制備的，表面較濕潤(rùn)，在斜面底部應(yīng)有少許冷凝水。 將變形桿菌接種于肉湯斜面上，在適宜的溫度下培養(yǎng)15至18小時(shí)后，用接 種環(huán)挑取斜面底部菌苔數(shù)環(huán)，輕輕地移入盛有1毫升與菌種同溫的無(wú)菌水 中，不要振動(dòng)，讓有活動(dòng)能力的菌游入水中，呈輕度混濁。在zui適溫度下保 溫10分鐘，讓老菌體下沉，而幼齡菌體在無(wú)菌水中可松開鞭毛。然后從試管 上端挑數(shù)環(huán)菌液，置于潔凈玻片的一端，稍稍傾斜玻片，使菌液緩慢地流向另一端。置空氣中自然干燥。 
（3） 染色： 
① 滴加A液，染4至6分鐘。 
② 用蒸餾水輕輕地充分洗凈A液。 
③ 用B液沖去殘水，再加B液于玻片上，在微火上加熱至冒蒸汽，約維 
持0.5至1分鐘（加熱時(shí)應(yīng)隨時(shí)補(bǔ)充蒸發(fā)掉的染料，不可使玻片出現(xiàn)干 
涸部分）。 
④ 用蒸餾水洗，干燥。 
⑤ 鏡檢 
結(jié)果：菌體和鞭毛呈深褐色至黑色。