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篩選和鑒定PCR酶切法重組子實驗分析

時間:2013/10/14閱讀:971
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重組子可通過酶切進行鑒定,也可以利用擴增引物通過 PCR 進行鑒定,陽性重組子能切出所需要的片段或得到相應(yīng)片段的 PCR 產(chǎn)物。

 

1. 用牙簽挑取平板上的菌落接種于 2ml 含適當抗生素的 LB 培養(yǎng)基中,37℃搖 床培養(yǎng)過。

 

2. 次日取菌液 0.2-0.5ml,13,000rpm×3min 離心,棄上清,加入 20μl ddH2O 20μl / 氯仿,震蕩混勻,13,000rpm×5min 離心。

 

3. 取上清進行瓊脂糖電泳,加入載體質(zhì)粒 DNA 作為陰性對照,根據(jù)質(zhì)粒大小 初步篩選重組子,重組子的泳動速度應(yīng)該慢于載體質(zhì)粒。

 

4. 用堿法小量制備可能是重組子的質(zhì)粒 DNA。

 

5. 選取適當?shù)拿福瑢χ亟M子進行酶切分析,酶切體積均為 10μl 體系。酶切樣品 進行瓊脂糖電泳鑒定是否有所需片段。

 

6. 酶切分析正確的重組子分成兩份,一份進行測序反應(yīng),另外一份保種。

 

7. 若用 PCR 法鑒定,則在第 2 步時每個樣本取 0.5-1.0μl 菌液為模板進行 PCR 反應(yīng),每管反應(yīng)體系zui低可少至 10μl ,PCR 產(chǎn)物電泳,能得到所需條帶的樣 本進一步提取質(zhì)粒酶切鑒定或送樣品測序。

 

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