影響E.coli 中蛋白表達量的因素除載體啟動子結(jié)構(gòu)以外,還有 質(zhì)粒拷貝數(shù)、質(zhì)粒穩(wěn)定性、mRNA結(jié)構(gòu)、密碼子的偏愛性和宿主菌的生長狀態(tài)等因素[58].由于 Vector NTI suitor7.0軟件模擬表達,可知mRNA結(jié)構(gòu)和密碼子的偏愛性兩個影響因素不會造成表達困難,所以本實驗的工作主要針對載體拷貝數(shù)、載體穩(wěn)定和宿主菌的生長狀態(tài).
本實驗中重組表達質(zhì)粒PrP-pET-32a（+）不穩(wěn)定的原因可能是PrP對E.coli BL21（DE3）具有細胞毒性.pET-32a（+）來源于pBR-322,pBR-322源于ColE1.ColE1、pBR-322 、pET- 32a（+）都失去了分配功能區(qū)par.而天然質(zhì)粒具有功能區(qū)par,可以保證質(zhì)粒在每次細胞周期中準確的進行分離,并均等的分配到子代細胞中去.功能區(qū) par對質(zhì)粒PrP-pET-32a（+）的穩(wěn)定性是*的[4].缺少功能區(qū)par的pET-32a（+）質(zhì)粒在每次細胞周期中隨機分配到子代細胞中去,無細胞毒性時約98% E.coli BL21（DE3）會帶有質(zhì)粒（見《pET System Manual》34頁）.表達有細胞毒性蛋白的E.coli BL21（DE3）不具有生長優(yōu)勢,而且隨細菌培養(yǎng)時間的增加β-內(nèi)酰氨酶將逐漸釋放到溶液中去,破壞溶液中的AMP.【β-內(nèi)酰氨酶功能強大,細菌培養(yǎng)稀釋1000倍以后還能破壞幾乎所有的AMP（見《pET System Manual》33頁）】.這樣本不具有生長優(yōu)勢的表達菌又失去了選擇壓力,造成大部分新生細菌無質(zhì)粒,表現(xiàn)為表達困難.本實驗證實約60%以上的細菌無質(zhì)粒.
鑒于以上原因,本實驗將融合蛋白Trx-PrPC 27-30表達分成兩個階段,前一個階段為質(zhì)粒生長階段,主要保證質(zhì)粒的穩(wěn)定性和提高質(zhì)粒的拷貝數(shù);后一個階段為融合蛋白表達階段,待細菌生長達飽和以后,誘導(dǎo)融合蛋白Trx-PrPC 27-30的表達.
在溫度、AMP濃度、培養(yǎng)基等諸多影響質(zhì)粒PrP-pET-32a（+）穩(wěn)定性的因素中,以溫度影響zui為明顯.實驗結(jié)果顯示,37℃條件下約60% 以上的細菌無質(zhì)粒PrP-pET-32a（+）,25℃條件下失去質(zhì)粒PrP-pET-32a（+）的細菌在約10%以內(nèi).其他條件不變,AMP濃度在 100 ug/ml以上細菌質(zhì)粒PrP-pET-32a（+）基本穩(wěn)定.隨AMP濃度增加平板上的菌落逐漸變小,表明AMP可抑制細菌生長.不同培養(yǎng)基對 PrP-pET-32a（+）的穩(wěn)定性無明顯影響,但TB培養(yǎng)基可提高蛋白表達量.實驗發(fā)現(xiàn)TB培養(yǎng)基比LB提高蛋白表達量約在5-10%之間.
本實驗中PrP-pET-32a（+）穩(wěn)定性高則融合蛋白Trx-PrPC 27-30表達量高.
溫度因素是影響本實驗融合蛋白表達量zui為明顯的因素.如圖2-9,37℃條件下,其他條件不管如何改變,都未見融合蛋白Trx-PrPC 27-30有明顯表達帶ColE1復(fù)制起點的質(zhì)粒,在加入以后可以抑制細菌蛋白的生長,但不抑制質(zhì)?？截悢?shù)的增加.雖然沒有文獻可以解釋這一現(xiàn)象,我們?nèi)钥梢酝茰y導(dǎo)致質(zhì)?？截悢?shù)增加的蛋白合成系統(tǒng)是獨立于細菌蛋白合成系統(tǒng)的,這個系統(tǒng)以一種相對穩(wěn)定速度合成質(zhì)粒.所以降低細菌生長速度可增加細菌質(zhì)?？截悢?shù)（并間接增加質(zhì)粒穩(wěn)定性）從而增加融合蛋白Trx-PrPC 27-30的表達量.本實驗在37℃條件下,誘導(dǎo)前OD600 為0.6時開始誘導(dǎo),4 h誘導(dǎo)培養(yǎng) ,菌液的OD600 值可達5,未見融合蛋白Trx-PrPC27-30的明顯表達;25℃條件下,誘導(dǎo)前OD600 為1.5,更換等體積新鮮TB誘導(dǎo)4h,菌液的OD600 值可達2.3,融合蛋白Trx-PrPC27-30的zui高表達量接近50%.變化如此之大,出乎意料.
AMP濃度是繼溫度條件以后,影響融合蛋白表達量的另一個重要因素.當(dāng)其他條件不變,AMP濃度在50 ug/ml以下時,融合蛋白Trx-PrPC 27-30的表達量在20%以下;AMP濃度在200-500 ug/ml條件下,Trx-PrPC 27-30呈高表達,表達量接近50%.但AMP濃度加到500 ug/mlAMP時則會使細菌的生長速度下降.說明一定的選擇壓力可以提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性從而提高融合蛋白表達量,200 ug/ml的AMP濃度為zui適表達濃度.
不同IPTG濃度對融合蛋白Trx-PrPC 27-30的表達量無明顯影響,0.1 mM的IPTG即可達到38%的表達量,1 mM IPTG可達zui高表達量;乳糖誘導(dǎo)條件下融合蛋白Trx-PrPC 27-30的表達量隨乳糖濃度增加而逐漸增加,但乳糖誘導(dǎo)融合蛋白Trx-PrPC27-30的zui高表達量（39.6%）比IPTG誘導(dǎo)的zui高表達量（45.7%）低.可能是由于乳糖提高了細菌的生長速度,間接降低了質(zhì)粒的拷貝數(shù),導(dǎo)致表達量下降.乳糖濃度太低時,細菌在誘導(dǎo)表達早期已將乳糖消耗干凈,造成誘導(dǎo)不足;乳糖濃度太高,細菌的生長速度過快,降低了質(zhì)粒的拷貝數(shù),融合蛋白Trx-PrPC 27-30的表達量又有所下降.所以乳糖誘導(dǎo)表現(xiàn)為融合蛋白Trx-PrPC 27-30的表達量,隨乳糖濃度增加由低到高,然后又略有下降.當(dāng)其他條件不變時,用3%乳糖誘導(dǎo)融合蛋白Trx-PrPC 27-30可達zui高表達量,而8%乳糖誘導(dǎo)表達量有所下降.
隨誘導(dǎo)時間的增加融合蛋白Trx-PrPC 27-30的表達量均勻增加,3 h以后接近zui高表達量,過夜誘導(dǎo)zui高表達量可達47%,甚至接近50%.誘導(dǎo)過程中細菌OD600 變化不大,由1.5上升為2.0-2.5.與此不同的是,37℃誘導(dǎo)條件下,無融合蛋白Trx-PrPC 27-30表達時,細菌OD600 值變化很大,誘導(dǎo)4 h,細菌OD600 值由0.6上升為5,表明細菌分裂并不是表達融合蛋白所需,甚至可導(dǎo)致蛋白表達量下降.細菌生長接近飽和以后,更換等體積新鮮培養(yǎng)基誘導(dǎo),可獲得高的蛋白表達量.
