蛋白質(zhì)組研究的發(fā)展以雙向電泳技術(shù)作為核心.雙向電泳由O’Farrell’s于1975年建立并成功地分離約1 000個(gè)E.coli蛋白,并表明蛋白質(zhì)譜不是穩(wěn)定的,而是隨環(huán)境而變化.雙向電泳原理簡明,*向進(jìn)行等電聚焦,蛋白質(zhì)沿pH梯度分離,至各自的等電點(diǎn);隨后,再沿垂直的方向進(jìn)行分子量的分離.目前,隨著技術(shù)的飛速發(fā)展,已能分離出10 000個(gè)斑點(diǎn)（spot）.當(dāng)雙向電泳斑點(diǎn)的全面分析成為現(xiàn)實(shí)的時(shí)候,蛋白質(zhì)組的分析變得可行.

樣品制備（sample prepareation）和溶解同樣事關(guān)2-DE的成效,目標(biāo)是盡可能擴(kuò)大其溶解度和解聚,以提高分辨率.用化學(xué)法和機(jī)械裂解法破碎以盡可能溶解和解聚蛋白,兩者聯(lián)合有協(xié)同作用.對(duì)IEF（isoelectric focusing）樣品的預(yù)處理涉及溶解、變性和還原來*破壞蛋白間的相互作用,并除去如核酸等非蛋白物質(zhì).理想的狀態(tài)是人們應(yīng)一步完成蛋白的*處理.而離液劑2 mol/L硫脲和表面活性劑4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白從IPG（immobilized pH gradients）膠上的轉(zhuǎn)換.三丁基膦（Tributyl phosphine,TBP ）取代β-巰基乙醇或DTT*溶解鏈間或鏈內(nèi)的二硫鍵,增強(qiáng)了蛋白的溶解度,并導(dǎo)致轉(zhuǎn)至第二向的增加].兩者通過不同的方法來增加蛋白的溶解度,作為互補(bǔ)試劑會(huì)更有效.在保持樣品的完整性的前提下,可利用超離和核酸內(nèi)切酶去除核酸（DNA）.除此之外,機(jī)械力被用來對(duì)蛋白分子解聚,如超聲破碎等.另外,添加PMSF等蛋白酶抑制劑,可保持蛋白完整性.由于商品化的IPG膠條是干燥脫水的,可在其水化的過程中加樣,覆蓋整個(gè)IPG膠,避免在樣品杯中的沉淀所致的樣品丟失].此外,低豐度蛋白（low abundance protein）在細(xì)胞內(nèi)可能具有重要的調(diào)節(jié)功能,代表蛋白質(zhì)組研究的“冰山之尖”,故分離低豐度蛋白是一種挑戰(zhàn).亞細(xì)胞分級(jí)和蛋白質(zhì)預(yù)分級(jí)、提高加樣量（已達(dá)到1～15 mg級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)）、應(yīng)用敏感性檢測(cè),可以提高其敏感性.如一種多肽免疫2-DE印跡（MI-2DE）是利用幾種單克隆抗體技術(shù)來分析和檢測(cè).提高組蛋白和核糖體蛋白等堿性蛋白（basic proteins）的分離是另一難點(diǎn).由于堿性pH范圍內(nèi)凝膠基質(zhì)的不穩(wěn)定及逆向電滲流（EOF）的產(chǎn)生,對(duì)PI（等電點(diǎn)）超過10的堿性蛋白,通過產(chǎn)生?0～10%?的梯度和16%的異丙醇可減少之.亦可用雙甲基丙烯酰胺來增加基質(zhì)的穩(wěn)定性.?

2-DE面臨的挑戰(zhàn)是高分辨率和重復(fù)性.高分辨率確保蛋白zui大程度的分離,高重復(fù)性允許進(jìn)行凝膠間配比（match）.對(duì)2-DE而言,有3種方法分離蛋白:1）ISO-DALT（isoelectric focus）以O(shè)’Farrell’s技術(shù)為基礎(chǔ).*向應(yīng)用載體兩性電解質(zhì)（carrier ampholyte, CA）,在管膠內(nèi)建立pH梯度.隨著聚焦時(shí)間的延長,pH梯度不穩(wěn),易產(chǎn)生陰極漂移.2） NEPHGE（non-equilibrium pH gradient electrophoresis）用于分離堿性蛋白（pH>7.0）.如果聚焦達(dá)到平衡狀態(tài),堿性蛋白會(huì)離開凝膠基質(zhì)而丟失.因此,在等電區(qū)域的遷移須在平衡狀態(tài)之前完成,但很難控制.3）IPG-DALT發(fā)展于80年代早期.由于固相pH梯度（Immobilized pH gradient, IPG）的出現(xiàn)解決了pH梯度不穩(wěn)的問題.IPG通過immobiline共價(jià)偶聯(lián)于丙烯酰胺產(chǎn)生固定的pH梯度,克服了IEF的缺點(diǎn),從而達(dá)到高度的重復(fù)性.目前可以制作線性、漸進(jìn)性和S型曲線,范圍或?qū)捇蛘膒H梯度.新的酸性pH 3～5或堿性pH 6～11的IPG凝膠梯度聯(lián)合商品化的pH 4～7的梯度可對(duì)蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)組重疊群（proteomic contigs）從而有效分離.

分離后的斑點(diǎn)檢測(cè)（spot detection）亦很重要.所采用的檢測(cè)策略和分離后所采用的方法的相互作用是很重要的.此外,還需考慮反應(yīng)的線性、飽和閾/動(dòng)態(tài)范圍、敏感性、對(duì)細(xì)胞蛋白群的全體定量分析的適應(yīng)性、可行性.目前,沒有一種蛋白染色覆蓋廣泛的濃度和PI及分離后分析技術(shù).銀染已成為一種檢測(cè)2-DE的流行方法,可檢測(cè)少到2～5ng的蛋白,因此較考馬斯亮藍(lán)R-250敏感.多數(shù)糖蛋白不能被考馬斯亮藍(lán)染色,一些有機(jī)染料不適于PVDF膜.放射性標(biāo)記不依賴其代謝的活性,并僅適于對(duì)合成的蛋白質(zhì)檢測(cè).另有一種改良的2-DE（差異凝膠電泳）,即應(yīng)用兩種不同的染料熒光標(biāo)記兩個(gè)樣品,使在同一凝膠上電泳后的凝膠圖象為兩個(gè),避免了幾種2-DE的比較,可在納克級(jí)進(jìn)行檢測(cè).

較早期相比,2-DE有兩個(gè)主要的進(jìn)步:首先,*的重復(fù)性使有機(jī)體的參考圖譜,可通過Internet獲得,來比較不同組織類型、不同狀態(tài)的基因表達(dá);其次,高加樣量使得2-DE成為一項(xiàng)真正的制備型技術(shù).