分析轉(zhuǎn)化的功能和表達(dá)需要DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞染色體。外源基因進(jìn)入細(xì)胞后，部分能夠通過細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核 內(nèi)，根據(jù)細(xì)胞類型，至多80%的進(jìn)入核內(nèi)的外源DNA得到瞬時(shí)表達(dá)。極少數(shù)情況下，進(jìn)入細(xì)胞的外源DNA通過系列非同源性分子間重組核連接，形成巨大的***結(jié)構(gòu)zui終整合進(jìn)細(xì)胞染色體。細(xì)胞基因組自由部分表達(dá)，所以整合并不一定意味著表達(dá)，只有整合到表達(dá)區(qū)的基因才會(huì)表達(dá)，而且整合到不同的染色體區(qū)段的外源基因的表達(dá)的量也是不同的。由于攝取、整合、表達(dá)外源基因是小概率事件，通常根據(jù)新表型篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體。一般情況下這種新表型由共轉(zhuǎn)染的編碼抗生素抗性基因提供。細(xì)菌Tn5轉(zhuǎn)座子序列(neo抗性基因)攜帶的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶可以將G418轉(zhuǎn)變成無毒形式。G418是一種氨基糖類抗生素，其結(jié)構(gòu)與*、*、*相似，它通過影響80S核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成，對(duì)原核和真核等細(xì)胞都有毒性，包括細(xì)菌、酵母、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，也包括原生動(dòng)物和蠕蟲。是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染zui常用的選擇試劑。當(dāng)neo基因被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組合適的地方后，則能啟動(dòng)neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為mRNA，從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，使細(xì)胞獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。G418的這一選擇特性，已在基因轉(zhuǎn)移、基因敲除、抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等方面得以廣泛應(yīng)用。

在進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞膜 受到影響，抗生素可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較大影響，加上G418有殺菌作用，所以有人主張轉(zhuǎn)讓時(shí)不加其它抗生素。其實(shí)G418本身有很好的殺菌效果，在用G418進(jìn)行篩選的過程中很少會(huì)發(fā)生污染。但有一點(diǎn)，其實(shí)我覺得問題也不是很大，那就是：在老外的一本實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中提到，在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時(shí)所用培養(yǎng)基中不加任何抗生素。我想他的想法可能是脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞膜有影響，可能此時(shí)加抗生素對(duì)細(xì)胞損傷較大。因?yàn)?、*、G418均是氨基糖甙類藥物，其藥理作用*一樣。所以沒有必要再用，而且由于另外抗生素的添加實(shí)際增加氨基糖甙類藥物的濃度，劑量有誤差，不利于各實(shí)驗(yàn)室之間的交流，在實(shí)際操作中，培養(yǎng)液中有抗生素對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)與篩選影響不大。

Protocol

1.G418的配制： 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸餾水至10ml，過濾消毒，4度保存。

2.細(xì)胞培養(yǎng) ：取待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，按等量接種入多孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)6小時(shí)左右開始加藥。

3.制備篩選培養(yǎng)基：在100μg/ml～1000μg/ml范圍內(nèi)確定幾個(gè)梯度，比如先做個(gè)100μg/ml、400μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml，按梯度濃度用培養(yǎng)基稀釋G418制成篩選培養(yǎng)基。

4.加G418篩選： 吸除培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基，PBS洗滌一次，每孔中加入不同濃度的篩選培養(yǎng)基。

5.換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3~5天更換一次篩選培養(yǎng)基。方法同4。

6.確定*篩選濃度：在篩選10～14天內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的zui小G418濃度即為*篩選濃度。在*輪就篩選出*G418濃度的可能性不大，zui有可能的是出現(xiàn)這種情況：用某一濃度G418的量在篩選14天后還不能殺死細(xì)胞，而用下一個(gè)梯度的G418的量在10天前就看不到活細(xì)胞了。假如是400μg/ml不能殺死細(xì)胞，而800μg/ml在第5天就把所有細(xì)胞都?xì)⑺懒?，則可以再用500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml進(jìn)一步篩選，以確定*篩選濃度!心得：由于特性明確的細(xì)胞系G418的*用量還是比較穩(wěn)定的，所以有時(shí)候不需要在這么大范圍內(nèi)進(jìn)行篩選。比如說你要轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，現(xiàn)在我告訴你我測(cè)試過NIH3T3細(xì)胞對(duì)G418的敏感性，我用的篩選濃度是200μg/ml。這時(shí)你就可以做150μg/ml、200μg/ml、300μg/ml三個(gè)濃度進(jìn)行篩選