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MTT比色法檢測IL-2的生物活性
點擊次數(shù)：311 發(fā)布時間：2012-5-8
【基本原理】
IL-2的生物活性檢測法是檢測IL-2對靶細胞（或反應細胞）的促增殖作用的能力。IL-2反應細胞增殖程度可以增殖細胞中DNA合成或酶活性為指示系統(tǒng)，通過測定3H-TdRDNA摻入量或MTT比色法OD值，并通過與標準品對照，間接測定IL-2的生物活性單位。以下三類細胞可作為IL-2的檢測細胞：①IL-2依賴細胞株，如CTLL，CTLL-2，尤以后者zui常用；②有絲分裂原活化的T淋巴母細胞；③小鼠胸腺細胞。下面主要介紹以CTLL-2細胞作為反應細胞檢測IL-2的生物學活性，又包括MTT比色法與3H-TdR摻入量兩種基本方法，其原理參見IL-1的生物活性檢測部分。
【材料和試劑】
（1） CTLL-2細胞：作為反應細胞或靶細胞。
（2） 待測樣品：從1:2開始作倍比稀釋，至少6個稀釋度。
（3） IL-2標準品：同上作倍比稀釋，至少6個不同稀釋度
（4） 10% FCS-RPMI-1640*培養(yǎng)液
（5） MTT：用PBS配成濃度為5mg/ml的MTT溶液，用0.22μm濾膜過濾除菌及雜質(zhì)，4℃避光保存。
（6） 酸化異丙醇：100ml異丙醇中加入0.4ml 36%HCl即可成為0.04mol/L HCl的異丙醇。
（7） 96孔細胞培養(yǎng)板，刻度吸管、毛細吸管，加樣器（頭），刻度離心管，離心機，細胞計數(shù)板，倒置顯微鏡，超凈工作臺，CO2培養(yǎng)箱，酶標測定儀，570nm和630nm濾光片。
【操作步驟】
（1） 用10% FCS-RPMI-1640*培養(yǎng)液洗滌CTLL-2細胞2次，1000r/min離心5min，以去除原生長培養(yǎng)液（含有IL-2）；
（2） 用10%FCF-RPMI-RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)細胞濃度為1×105/ml；
（3） 將不同倍比稀釋度的IL-2的標準品及待測樣品分別加入96孔培養(yǎng)板中，100μl/孔，各設3復孔，并同時設培養(yǎng)液對照；
（4） 各孔內(nèi)均加入CTLL-2細胞懸液，100μl/孔；
（5） 置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h（18-24h均可）；
（6） 細胞培養(yǎng)至18-24h時，各孔加入MTT溶液，10μl /孔繼續(xù)培養(yǎng)4h；
（7） 取出培養(yǎng)板，先從各孔中輕輕吸出100μl上清液棄去。再加入酶化異丙醇或DMSO，100μl/孔，置室溫10-20min，吹打震蕩，充分混勻，使MTT-甲肷產(chǎn)物充分溶解；
（8） 用酶標儀的檢測波長570nm，參考波長630nm，分別測定各孔OD值，測定應在加入酸化異丙醇后1h內(nèi)完成。
【結(jié)果分析】
（1） 每孔OD值應取3復孔的平均值，zui終各孔OD值應為OD570nm-OD630nm，再減去培養(yǎng)液對照孔OD值；
（2） 按概率單位分析法計算IL-2活性單位（參見IL-1的生物活性檢測法部分）：樣品IL-2活性單位采用下列公式計算：
樣品IL-2活性單位（U/ml） = 達標準品zui大OD值50%的樣品稀釋度 × 標準品IL-2活性單位
（U/ml）
達zui大OD值50%對應的標準品稀釋度
【注意事項】
（1） CTLL-2細胞存活率應＞95%（細胞折光性好，形態(tài)飽滿），洗滌時操作不要太猛烈，因CTLL-2細胞膜極脆，容易破碎而影響檢測結(jié)果。
（2） CTLL-2細胞要充分洗滌，因原生長培養(yǎng)液中含有IL-2。
（3） CTLL-2細胞對鼠IL-4亦有增殖反應，若樣品中含有鼠IL-4，將影響檢測結(jié)果準確性，此時可用抗鼠IL-4 McAb處理待測樣品后再進行檢測。但CTLL-2細胞對人IL-4無增殖反應。
（4） CTLL-2的*終濃度宜為1×104/孔，且應均勻分布。
（5） CTLL-2細胞凍存后復蘇較為困難，而長期培養(yǎng)又易產(chǎn)生變異而干擾IL-2活性測定，應加以注意。
（6） IL-2標準品及待測樣品從1:2開始至少6個倍比稀釋度，加樣時應從低濃度到高濃度順序加入，且不可共用加樣器頭。
（7） 加入MTT的*時間應為培養(yǎng)液對照（無IL-2）孔細胞全部死亡時，一般時間是細胞培養(yǎng)至18-24h時。
（8） 加入酶化異丙醇后，應在1h內(nèi)進行OD測定。如果1h內(nèi)無法測定，可將未加酸化異丙醇的96孔培養(yǎng)板暫時放入4℃冰箱保存。測定前，取出置室溫下數(shù)分鐘，再加入酶化異丙醇進行OD值測定。
（9） 因RPMI-1640培養(yǎng)液中含有的酚紅可干擾OD值測定，而加入酶化后的異丙醇，可使培養(yǎng)液中的酚紅在酸性條件下由紅色變成黃色，從而可排除紅色對OD值測定的干擾；此外，設立培養(yǎng)液對照，可進一步排除培養(yǎng)液對OD值測定的影響。
（10） IL-2活性單位計算方法有多種，除在IL-1活性單位計算法中所述的方法外，還可通過正態(tài)概率紙法、概率單位法計算IL-2活性單位，亦可對結(jié)果進行計算機處理，得出IL-2的活性單位。有關計算方法可參閱醫(yī)學統(tǒng)計學的有關內(nèi)容。